高校生物 制限酵素の切断地図—直鎖と環状DNAの断片を復元する｜武蔵野個別指導塾

単独消化と二重消化の長さを足し戻し、直鎖と環状DNAの切断位置を求めます。重なる断片や不完全な切断がある資料では、地図を決める根拠を確かめます。

高校生が環状DNAの切断点数にいつも1を足して断片数を出す場面があります。直鎖では両端が最初から分かれているため、その数え方が使えます。しかし輪には端がありません。最初の1か所を切ると輪が開いて直鎖になり、切断点が1か所でも断片は1本です。形を確かめてから断片を数えると、単独消化と二重消化の資料を同じ地図に戻せます。

何を手がかりに地図を描くか

問題には大きく3つの型があります。第1に、切断位置が与えられ、直鎖または環状のDNAから断片数と長さを求める型です。第2に、各酵素を別々に作用させた単独消化と、両方を作用させた二重消化の結果を比べ、切断点の位置関係を推定する型です。第3に、観測された長さが想定と違うとき、切断の不完全さや測定誤差を考え、地図を決められる範囲を述べる型です。

計算に入る前に、DNAの形、全長、各酵素の切断点、切断が完全かを確認します。以下の長さは塩基対を単位とする自作の条件で、地図上の距離を表します。切断点は異なる位置にあり、完全消化では指定された点がすべて切れるとします。断片長の和が元の全長に戻るかも毎回確かめます。

認識部位から断片まで

制限酵素は特定の塩基配列を認識し、DNAを切断します。認識される配列を認識部位といい、酵素ごとに認識する配列や切断の仕方が異なります。二本鎖の切り口には、片鎖が突き出た末端と、両鎖がそろった末端があります。前者は相補的な配列を持つ末端と塩基対を作れますが、末端の対応は断片の長さだけでは決まりません。

切断地図は、DNA上の切断位置とその間の距離を示す模式図です。認識部位の配列そのものと、長さを測るための切断点は区別します。以下では切断のずれが断片長に与える差を考えないよう、問題で指定した点を距離の基準とします。実際の部位の配列や末端の配列を、この距離だけから復元することはできません。

図1のように、直鎖の内部に異なる切断点が2か所あれば、元の両端と切断点が3区間を作ります。環状では輪に沿って隣の点までを数え、2か所なら2区間です。輪に切断点が1か所のときは、その点から一周して同じ点に戻る1区間です。0か所なら環状のまま1分子であり、「点数と断片数が等しい」という関係は切断点が1か所以上の完全消化に限って使います。

図1の2つの印は別々の切断点です。直鎖では内部の点が1つ増えるたびに既存の1断片が2つに分かれ、総数が1増えます。環状では最初の切断が輪を開くだけで分子数を増やさず、2か所目以降は1か所ごとに1断片ずつ増えます。同じ位置を2種類の酵素が切ると指定された場合は、位置を二重に数えません。

単独消化の断片長は、その酵素の隣り合う切断点の間隔を教えます。ただし長さの一覧には、どの断片がどの断片の隣にあるかが書かれていません。二重消化では別の酵素の切断点が加わり、単独消化の断片のどれかがさらに分割されます。分割前後の長さを足し合わせて対応させれば、位置関係の候補を絞れます。

電気泳動の資料では、同じ長さの断片が重なることがあるため、バンドの本数をそのまま断片数にしません。問題が断片の本数を明示する場合と、バンドの位置だけを与える場合は情報量が異なります。濃さを使う推定にも測定条件が必要です。長さの和が合わない場合は、計算違いだけでなく、重なりや見落としも候補に残します。

基本例題：直鎖のどこが分割されたか

長さ12塩基対の直鎖DNAがあります。左端を0、右端を12とし、酵素Aは位置4、酵素Bは位置9を切ります。完全消化を仮定します。A単独、B単独、二重消化それぞれの断片長を、塩基対を単位として小さい順に答えてください。

まず形は直鎖で、元の両端は0と12です。A単独では0から4までが4、4から12までが8です。したがって4、8塩基対の2断片です。和は12で、切断点1か所に対して断片数は2です。

次にB単独では0から9までが9、9から12までが3です。小さい順に3、9塩基対で、和は12です。AとBを同時に数えると、位置の順序は0、4、9、12です。隣り合う値の差は4、5、3なので、答えは3、4、5塩基対です。

図2のようにA単独の8塩基対の断片がBの位置で5と3に分かれ、4はそのまま残ります。B単独の9塩基対の断片もAによって4と5に分かれます。両方向の対応を確認すると、3つの和が12に戻るだけでなく、どの酵素がどの断片を分けたかも説明できます。

別解ではAの8からBまでの距離を先に求めます。Aの位置4からBの位置9までが5、Bから右端までが3なので、Aの8は5と3に分かれます。ただし、同じ長さの断片が複数ある資料では、長さの一致だけで位置を一意に決めず、ほかの候補も調べます。

標準例題：環状の位置を決める

全長18塩基対の環状DNAについて、Aは位置0と6を切り、Bは位置10を切ります。位置は輪上の同じ向きに測ります。完全消化のA単独、B単独、二重消化の断片長を小さい順に求め、二重消化でどの断片が分かれたか説明してください。

Aの2点の間は0から6まで6、6から0へ一周の残りが12です。A単独は6、12塩基対です。Bの切断点は1か所なので、輪が開いた18塩基対の直鎖が1本になります。二重消化の点を0、6、10の順にたどると、区間は6、4、8です。答えは4、6、8塩基対で、4と8の和が12です。A単独の12がBにより分割され、6は残ったとわかります。

逆に単独と二重の断片長から考えると、BはAの12塩基対の区間内にあり、両端からの距離が4と8です。輪の向きに目印がなければ、反転して描いた地図は同じ位置関係を表します。断片長だけでは、紙の上の時計回りの向きや実際の塩基配列までは決まりません。解答では、同じ地図を回転や反転で描き直したものと、異なる候補とを区別します。

発展例題：資料が期待どおりでないとき

全長20塩基対の環状DNAで、切断地図はAが位置0と8、Bが位置13とします。完全消化ならA単独、B単独、二重消化の断片長は何ですか。ある自作資料では二重消化の断片として5、7、8に加えて12塩基対も検出されました。この資料だけで地図が誤りだと断定できるか、理由と追加の比較を述べてください。

A単独は8と12、B単独は20、二重消化は0から8が8、8から13が5、13から0が7です。それぞれの和は20です。二重消化で12も検出されたことは完全消化の予測と一致しませんが、これだけで地図が誤りとは断定できません。例えばAの2点は切れたがBの点が切れなかった分子が混ざれば、A単独と同じ12の断片が残りえます。逆に別の地図、別の長さの混入や測定上の誤りも考えられます。各バンドが同じ分子から生じたとは限らないので、検出された長さを全部足して20と比較することもできません。

比較には、同じDNAを用いた未消化、A単独、B単独、二重消化の資料を並べます。各条件で同じ長さの標準を使って位置と長さを対応させ、同じ条件の反復も比べます。横軸に泳動位置、縦軸に検出の強さをとる資料なら、軸の単位と基準を確認し、ピークの位置を長さの標準と照合します。強さは量や検出の条件にも左右されるため、ピークの数や高さをそのまま切断点数にはしません。

例えば長さの読み取りに各断片あたり1塩基対程度の観測誤差があると問題で与えられたなら、5と6程度の差は測定値だけで区別しにくい場合があります。これは計算の丸めではなく、資料を読む精度の限界です。対照が期待に合っても、同じ長さの断片の重なりや未検出の短い断片は残りえます。別の切断点を使う比較や、長さ以外の位置情報を追加すると候補をさらに絞れますが、結果が得られる前に一意と書くことはできません。

間違えた地図を直す

図3のように、環状DNAの2か所を切って3断片と答えた場合は、直鎖の端を輪にも持ち込んでいます。輪に沿う区間を実際に1周し、出発した点に戻るまでに通る区間を数え直します。切断点が0か所の場合も、0断片ではなく、切られていない環状分子が残ります。

もう1つの誤答は「二重消化の断片長が単独消化と異なるので、元のDNAの全長が変わった」です。完全消化は既存の区間を細かく分けるので、断片の数は増ええますが、全長の合計は変わりません。まず二重消化の断片を組み合わせ、各単独消化の断片に戻せるか試します。戻せないときは転記、重複、切断不完全、検出限界、誤差などを検討し、条件を勝手に変更して合わせないことが必要です。

同じ断片長の集合から複数の並びが作れることもあります。そのとき1つの図を描けたことは、唯一の解を示したことになりません。候補ごとに各酵素の点を消して単独消化を再現し、全条件を満たすか確かめます。点の位置を与えない観測資料からは、反転や回転を除いても複数の地図が残ることがあります。

練習：区間を戻して確かめる

以下はそれぞれ独立した自作条件です。切断点は示された位置にあり、特に断らなければ完全に切れます。長さの答えは塩基対を単位とし、小さい順に示してください。

1. 全長15の直鎖を位置5と11で切ります。断片数と各長さを求めてください。
2. 全長21の環状DNAを位置0、7、16で切ります。断片数と各長さを求めてください。位置は輪に沿った距離です。
3. 全長24の直鎖でAは位置6、Bは位置17を切ります。A単独と二重消化の長さを求め、A単独のどの断片が分割されるか答えてください。
4. 全長30の環状DNAでAは位置0と9、Bは位置23を切ります。A単独と二重消化の長さを求め、Bが分けるA単独の断片の長さを答えてください。
5. 全長28の環状DNAで、Aは位置0と10、Bは位置18を切ります。二重消化の期待される長さを求め、実際の資料に18塩基対の断片もあったとき、完全消化の結果だけで説明できるか、また地図の誤りと断定できるかを答えてください。

練習の答えと道筋

1. 3断片で、4、5、6塩基対です。両端を含む位置は0、5、11、15なので差を順にとります。5と6と4を戻して足すと15で、切断点2か所から3区間ができます。
2. 3断片で、5、7、9塩基対です。0から7が7、7から16が9、16から一周して0までが5です。和は21で、輪上の3点が3区間を囲みます。直鎖のように1を足しません。
3. A単独は6、18、二重消化は6、7、11塩基対です。0から6、6から17、17から24の差を使います。11と7を戻すと18なので、A単独の18がBにより分かれます。6と18の和も二重消化の和も24です。
4. A単独は9、21、二重消化は7、9、14塩基対です。0から9が9、9から23が14、23から0までが7です。14と7を合わせると21になり、A単独の21が分けられます。どちらの長さの和も30です。
5. 期待は8、10、10塩基対です。0から10が10、10から18が8、18から0が10で、合計28に戻ります。同じ長さの10が2断片あることに注意します。完全消化だけなら18は予測されませんが、Aの2か所は切れ、Bの点が切れなかった分子から18が残る可能性もあるため、地図の誤りとは断定できません。単独消化と未消化の対照、長さの標準、反復を比べ、他の原因も検討します。

地図に戻すための要点

• 直鎖の内部の切断点がnか所なら、完全消化ではnに1を足した数の断片です。
• 環状では1か所以上の異なる切断点の数と断片数が等しく、0か所なら環状のまま1分子です。
• 二重消化の区間を足し戻し、両方の単独消化と元の全長に合うか調べます。
• 同じ長さの重なり、切断不完全、測定誤差と位置情報の不足を区別します。

答案のどこで止まったか

断片数が合わない答案では、まず輪に端を描いていないかを見ます。長さが合わないときは、位置の差を一周分まで書き出し、和が全長に戻るかを問い返します。個別指導では、二重消化の短い区間をどの単独消化の断片へ足し戻したか、図に印を付けて説明してもらいます。候補が複数残る場合に、何を追加すれば区別できるかまで考えると、切断地図の答えと根拠が結びつきます。