高校生物 cDNAとゲノムDNA—増幅断片の長さからイントロンを考える｜武蔵野個別指導塾

成熟mRNA由来のcDNAとゲノムDNAで対応する端をそろえ、断片長の差を計算します。逆転写なしの対照から混入を考える際も、検出の限界を踏まえましょう。

よくあるのは、ゲノムDNAの図にイントロンが描かれているため、そこから作るcDNAにも必ず同じイントロンが残るとして長さを求める場面です。実際には、何を材料にしたかが分かれ目です。成熟mRNAを材料にしたcDNAなら、取り除かれたイントロンを元に戻してから写すわけではありません。2種類の鋳型について、同じ範囲をどう数えるかを追います。

比べる前に決めること

出方の1つは、エキソンとイントロンの長さを与え、ゲノムDNAとcDNAから得られる増幅断片の長さを求める型です。両端の位置と、プライマー自身を長さに含むかを読み落とすと、イントロンを正しく扱っても答えがずれます。もう1つは、泳動像のバンドを比較し、RNA由来の産物とゲノムDNAの混入を見分ける型です。バンドの有無だけでなく、逆転写を行わない対照や鋳型を入れない対照が必要です。

さらに、差が現れなかった資料の解釈も問われます。2つのプライマーにはさまれた部分にイントロンがなければ、成熟mRNA由来のcDNAとゲノムDNAの産物は同じ長さになりえます。同じ長さという結果は、両者が同じ物質である証拠にはなりません。問題に示された領域と、測定で区別できる範囲を先に押さえます。

RNAを経由すると何が変わるか

真核生物の遺伝子では、転写によって作られたRNAの前駆体からイントロンが除かれ、エキソンがつながって成熟mRNAとなります。エキソンは成熟RNAに残る領域で、残った部分がすべてタンパク質に翻訳されるという意味ではありません。非翻訳領域も含みえます。ゲノムDNA自体からイントロンが切り取られるという説明でもありません。

逆転写酵素はRNAを鋳型として相補的なDNAを合成します。このRNAに対応して作られたDNAをcDNAと呼びます。RNAを経由するため、成熟mRNAを鋳型とした場合、スプライシングで除かれたイントロンはそのcDNAには対応しません。図1のように、ゲノム上で離れたエキソンが成熟RNA上ではつながり、その対応がcDNAに写されます。図の矢印は材料から産物への関係を示し、分子の移動方向を表しません。

ただし、cDNAという名前だけで、どのRNAを元にしたかは決まりません。未成熟の転写産物に由来する場合や、スプライシングのされ方が異なるRNAがある場合には、対応する配列も異なりえます。また、材料のRNAにゲノムDNAが混入すれば、後のPCRでゲノム由来の断片も得られえます。問題で「成熟mRNA由来」「混入なし」などと与えられた条件を答案に反映させます。

PCRでは、2つのプライマーがそれぞれ相補的な位置に結合し、向かい合う方向に伸長する条件の下で、その間を含む領域が増幅されます。以下では両プライマーがゲノムとcDNAの共通のエキソン部分に結合し、同じ外側の端を定めるとします。増幅断片の長さは、その外側の端からもう一方の外側の端までで数え、両プライマーの部分も含めます。

共通範囲に含まれるエキソンの長さの和をE、間にあるイントロンの長さの和をIとします。指定した成熟mRNAでそれらのエキソンがつながるなら、cDNA由来の断片はE塩基対、ゲノム由来はEとIを足した長さです。したがって、ゲノム由来の長さからcDNA由来の長さを引いた値はIになります。この差がイントロンの合計となるのは、両者の端が対応し、そのほかの挿入や欠失がなく、指定した成熟RNAに対象のエキソンが残るという条件の下です。

基本例題：端をそろえて数える

自作の遺伝子モデルで、2つのプライマーの外側の端にはさまれるゲノム領域は、左からエキソン部分120塩基対、イントロン180塩基対、エキソン部分80塩基対です。両エキソンは成熟mRNAで隣り合い、2つのプライマーは両方の鋳型の対応位置に結合します。混入や別の産物はないとします。ゲノムDNAと、この成熟mRNA由来のcDNAから得る断片の長さを、それぞれ塩基対の整数で求めてください。

図2のように、はさまれた領域を左から区切ります。ゲノムDNAでは3部分が続くため、120 + 180 + 80で380塩基対です。cDNAではイントロンに対応する部分を除き、120 + 80で200塩基対です。差は380 − 200で180塩基対となり、与えられたイントロンの長さに戻ります。

別の見方では、最初にゲノムの380塩基対から除かれる180塩基対を引いて、cDNAの200塩基対を得られます。逆に200塩基対に180塩基対を戻すと380塩基対です。どちらの計算も、プライマーの外側の端が共通という条件が必要です。遺伝子全体の長さを数えたのか、プライマーにはさまれた長さを数えたのかを答えの横に書くと、条件を点検しやすくなります。

標準例題：複数のイントロンを扱う

別の自作モデルで、共通の端にはさまれるゲノム領域は、左からエキソン部分90、イントロン140、エキソン70、イントロン110、エキソン部分60塩基対です。成熟mRNAでは3つのエキソン部分がこの順につながり、共通の端から増幅できるとします。2種類の断片長とその差を塩基対の整数で求め、差が表すものを答えてください。

まず成熟RNAに残る部分の和は90 + 70 + 60で220塩基対です。イントロンの和は140 + 110で250塩基対です。ゲノムでは両者を合わせて470塩基対、cDNAでは220塩基対、差は250塩基対です。差はこの領域内の2つのイントロンの長さの合計を表します。差だけから、それぞれが140塩基対と110塩基対であることは決められません。たとえば、ほかの組合せでも合計が250塩基対なら同じ差になるためです。

検算では220 + 250が470に戻ることに加え、90 + 140 + 70 + 110 + 60も470になることを確かめます。ゲノムを直接足す方法と、残る部分と除かれる部分に分ける方法は、区切りの転記ミスを見つけ合えます。長さの差からイントロンの数まで確定したくなったら、和が同じ別の分け方を考えます。

発展例題：バンドと対照を読む

自作の資料を考えます。同じ細胞由来の試料について、対象の成熟mRNA由来なら300塩基対、混入したゲノムDNA由来なら500塩基対の産物ができると予測されます。両者はこの測定で区別でき、プライマーは両方の対応位置を増幅するとします。逆転写を行った試料では300と500塩基対、逆転写を行わず他の条件を対応させた試料では500塩基対のバンドが検出されました。鋳型を加えない対照はバンドなしでした。各バンドについて言えることと、結論の限界を述べてください。

500塩基対は逆転写を行わない試料でも検出されたので、RNAをcDNAに変える操作を経なくても増幅される材料が試料に存在したことを示します。与えられた候補の下では、ゲノムDNAの混入と整合します。300塩基対は逆転写を行った試料に現れ、成熟mRNA由来のcDNAと整合します。一方、鋳型を加えない対照にバンドがないことは、その対照で検出可能な増幅産物が見られなかったことを示します。

この資料だけではバンドの配列そのものを確認していません。長さが同じ別の産物が生じる可能性を条件から除けない実際の資料では、長さだけで由来を断定しないことが必要です。また、逆転写なしの対照が陰性でも、検出限界より少ない混入がないとは言えません。逆転写ありの試料が陰性なら、対象RNAが存在しない可能性のほか、RNAの損傷や逆転写・増幅・検出の不成立も考えられます。陽性の参照試料やRNAの状態を確かめる別の指標を併せて考え、どの段階まで判断できるかを絞ります。

泳動像を模式グラフとして読むなら、横方向は各試料、縦方向はサイズ標準に対応する断片長で単位は塩基対です。実際の移動距離から長さへの対応は標準と比較して読みます。同じ位置に重なる断片は1本のバンドに見えることもあり、バンドの本数は分子の個数ではありません。自作資料の位置には読み取り誤差があり、近い長さを区別できない場合には差を細かく断定できません。バンドの濃さも、この条件だけで元のRNA量に比例すると決められません。

誤答から条件へ戻る

誤答例は「ゲノムにイントロンがあるので成熟mRNA由来のcDNAにも必ず残る」です。図3のように、転写後のRNAの変化を飛ばすと、DNAからDNAへ直接写したように考えてしまいます。修正するときは、ゲノムDNA、成熟mRNA、cDNAの順に材料を記し、イントロンが除かれる段階と逆転写の段階を分けます。

別の誤答は「短いバンドが出たので発現量が多い」です。長さの短い産物が検出されたことと、初めのRNA量の大小は別の判断です。産物の量には複数の段階が関わり、この資料に定量の条件はありません。答案には「指定された成熟mRNA由来と整合する」と、観察と推論の間の条件を書きます。

さらに「バンドが出なければ遺伝子が存在しない」とするのも飛躍です。プライマーが対応しない、反応が成立しない、産物が検出限界未満であるなど、陰性には複数の説明があります。比較に使う陽性対照が期待どおりかを見てから、結論を限定します。逆に鋳型なし対照にもバンドが出たときは、その結果を無視せず、汚染や非特異的な産物などを検討し、試料のバンドだけから由来を決めないようにします。

練習問題

各問は独立した自作モデルです。長さはプライマーの外側の端を含み、特記がなければ共通の端を使い、混入や別の産物はないとします。長さは塩基対の整数で答えてください。

1. ゲノムの対象領域はエキソン部分50、イントロン160、エキソン部分130塩基対です。成熟mRNAでは両エキソンがつながります。ゲノムとcDNAの断片長を求めてください。
2. ゲノム由来の断片が740塩基対、同じ端をもつ成熟mRNA由来のcDNA断片が410塩基対でした。この範囲に含まれるイントロンの長さの合計を求めてください。ほかの配列の差はないとします。
3. 対象領域にはエキソン部分が順に40、100、150塩基対、間にイントロンが順に60、200塩基対あります。成熟mRNAには3つのエキソンがこの順に残ります。2種類の断片長と差を求めてください。
4. 対応する2つのプライマーが同じエキソン内の両端を定め、その間の長さは260塩基対です。このエキソンは成熟mRNAに残り、ほかに配列の差はありません。2種類の断片長を求め、長さだけで由来を区別できるか答えてください。
5. 逆転写を行った試料で予測どおりの短いバンドがなく、逆転写なしの試料も陰性でした。同時に調べた陽性参照試料も陰性でした。対象RNAが存在しないと結論できるか、理由と次に確認する対象を述べてください。

解答と考え方

1. ゲノムは50 + 160 + 130で340塩基対、cDNAは50 + 130で180塩基対です。180に除かれた160を加えると340に戻ります。差は与えられたイントロンの160塩基対と一致します。
2. 740 − 410で330塩基対です。410に330を加えるとゲノムの740に戻ります。与えられた条件では差はイントロンの合計ですが、その個数や各長さは決まりません。
3. cDNAは40 + 100 + 150で290塩基対、イントロンの合計は60 + 200で260塩基対です。ゲノムは290 + 260で550塩基対、差は260塩基対です。各部分を順に足しても550となり、条件に戻ります。
4. どちらも260塩基対で、長さだけでは区別できません。対象範囲に除かれるイントロンがないためです。260から260を引くと差は0で、与えられた範囲にイントロンがない条件に合います。遺伝子の別の場所にイントロンがあるかどうかはこの結果から決まりません。
5. 結論できません。陽性参照試料も陰性なので、対象RNAの有無とは別に、増幅や検出など共通の段階が成立しなかった可能性があります。まず陽性参照と試料に共通する反応・検出の状態を確認します。逆転写なしの陰性も、その対照で検出された産物がないことを示すにとどまり、試料が正しく測定された保証にはなりません。

要点

成熟mRNAを鋳型とするcDNAには、除かれたイントロンに対応する部分がありません。 共通の端を定め、残る部分と除かれる部分を別々に足します。 長さの差をイントロンの合計とするには、ほかの配列差がない条件が必要です。 逆転写なしと鋳型なしの対照は、それぞれ異なる原因を調べます。 陰性や同じ長さの結果には複数の説明があり、検出の限界も考えます。

答案のどこで迷ったか

個別指導では、まず答案の線分にプライマーの外側の端が記されているかを見ます。次に、RNAからcDNAへ移る矢印の前に、イントロンを除いた成熟RNAが描かれているかを問い返します。長さの計算が合っていても、対照から言えることを広げすぎていないかは別に点検します。材料と比較範囲を明示すると、断片長の差が何を表すかを筋道立てて説明できます。