高校生物 PCRの産物数—理想的増幅と目的の長さの分子を分けて数える｜武蔵野個別指導塾

各サイクルの鋳型を追い、全二本鎖から両端のそろわない分子を除いて数える対象はPCR産物です。

よくあるのは、高校生がPCRの最初のサイクルから全分子を目的の長さと考え、二本鎖が倍になるという式をそのまま答えにする場面です。倍になることと、両端の位置が決まることは別の条件です。鎖がどの鋳型から生じたかを追うと、同じ反応の中に長さの異なる産物が混じる理由が見えてきます。

何を数える問題か

1つ目の型は、一定回数のサイクル後の二本鎖の総数を求める問題です。出発分子数と、毎回各鎖から新しい鎖が1本ずつできるという条件を確認します。2つ目は、2本のプライマーで挟まれた範囲と同じ長さの二本鎖を求める問題です。総数から、両端がまだそろわない分子を除きます。3つ目は、観測資料と理想モデルを比べ、差があっても原因を一つに決められないことを説明する問題です。

以下では、両プライマーが正しい位置で互いに向かって伸長し、材料は十分で、各サイクルで全鋳型から対応する鎖が1本ずつ作られると仮定します。元の二本鎖は両プライマーの位置より外側にも続きます。元の鎖や新生鎖が途中で失われず、区別した鎖が組になって二本鎖を作るモデルです。実際の測定値や実施条件を示すものではありません。出発時に目的の長さの二本鎖が混ざる場合や、別の場所でも増幅される場合には、以下の式をそのまま使えません。

鎖の端を追う

PCRでは、二本鎖が分かれ、それぞれの鎖を鋳型としてプライマーから新しい鎖が伸びます。DNAの新生鎖は5′から3′へ伸長し、相手の鎖とは逆向きに対応します。プライマーの位置は新生鎖の一端を定めますが、最初に元の長い鎖を鋳型にした新生鎖の反対側の端は、もう一方のプライマーの位置では定まりません。このモデルでは、その鎖を一端だけが定まった長い鎖と呼びます。

図1のように、一端だけが定まった鎖を次に鋳型にすると、その端で新生鎖が終わります。新しい鎖は自分のプライマーから始まるため、両端が目的の位置にそろいます。ただし、その時点では相手は一端だけが定まった長い鎖です。両端がそろった鎖をさらに鋳型にして初めて、両端がそろった鎖どうしの二本鎖が生じます。

図1の矢印はサイクルを経た鋳型から新生鎖への関係を示し、鎖の伸長方向そのものを示してはいません。実際には両側のプライマーから伸びる鎖があり、左右を入れ替えた関係も同時に進みます。図はその一方を簡略に描いたものです。目的の長さの鎖が現れる時期と、その鎖2本からなる二本鎖が現れる時期を区別してください。

出発した二本鎖を1分子とします。各サイクル後の総数は1、2、4、8と倍になり、n回後は2ⁿ分子です。一方、元の2本の鎖はそれぞれ毎回、長い新生鎖と組になりますので、元の鎖を含む二本鎖は常に2分子です。初回以降に作られる一端だけが定まった長い鎖は、各サイクルで2本ずつ増えます。元の鎖を含まない場合、それらは両端のそろった短い鎖と組になります。したがってn回後、目的の長さではない二本鎖は、nが1以上なら元の鎖を含む2分子と、一端だけの長い鎖を含む2(n-1)分子の合計2n分子です。

よって目的の長さの二本鎖は、nが1以上のとき2ⁿ − 2n分子です。0回では出発分子が長いという条件から0分子です。式は鎖数ではなく二本鎖の分子数を表します。長い鎖を数えた後で二本鎖へ対応させたことが重要です。各長い鎖を含む二本鎖には長い鎖が1本ずつありますので、この対応が成立します。

この数え方は、元の2本の鎖が繰り返し鋳型として残ることに支えられます。各回に新たな長い鎖が2本増える一方、目的の短い鎖は既にできた短い鎖からも増えます。したがって目的外の数は直線的に増え、全体は倍々に増えます。端の種類ごとに増え方が異なることが、両者の差を生む理由です。

基本例題：3回後を台帳で数える

両端が目的領域より外に続く二本鎖DNAを1分子用意したとします。上の理想条件で3回のサイクルを終えたとき、全二本鎖と、両端がプライマーの位置で定まった二本鎖はそれぞれ何分子ですか。整数で答えてください。

まず元の2本をO、一端だけ定まる長い鎖をL、両端が定まる短い鎖をSと呼びます。左右の鎖の向きは異なりますが、ここでは端の種類でまとめます。Oを鋳型にするとL、Lを鋳型にするとS、Sを鋳型にするとSができます。鋳型は新しい鎖と組になるので、各組の由来を順に書きます。

図2のように2回後のLとSの組は、次の回でLを鋳型にしたLとSの組と、Sを鋳型にしたSとSの組を1組ずつ生みます。2回後にはこのLとSが2組あるため、3回後に目的の二本鎖が2分子できます。Oを含む2組も次にそれぞれOとL、LとSを作るので、LとSは合計4組です。

答えは全二本鎖が8分子、目的の長さが2分子です。式でも2³ − 2・3は2です。残りの6分子はOを含む2分子とLとSの4分子で、合計を戻すと8分子です。2回後に短い鎖が2本あることを、短い二本鎖が2分子あることと取り違えないでください。

標準例題：出発分子が複数のとき

同じ条件の長い二本鎖を3分子から始め、4回のサイクルを終えます。全二本鎖と目的の長さの二本鎖をそれぞれ整数の分子数で求めてください。各出発分子は同じように増えるとします。

1分子からの総数は2⁴で16分子です。このうち目的の長さでない二本鎖は2・4で8分子です。したがって目的の長さは16 − 8で8分子です。出発分子が3分子ですから、全体は48分子、目的の長さは24分子です。残りも3・8で24分子となり、目的の分子と足して48分子に戻ります。

別解では、1分子からの台帳を1回進めます。3回後のOとLが2組、LとSが4組、SとSが2組から、4回後はOとLが2組、LとSが6組、SとSが8組です。合計16組を3倍すると同じ答えです。この方法なら式を忘れても端の種類から導けます。なお24本ではなく24分子であり、目的の二本鎖を構成する鎖は48本です。

発展例題：資料から言える範囲

長い二本鎖1分子を出発点とする理想モデルについて、横軸をサイクル数、縦軸を二本鎖分子数とするグラフを考えます。2回後と5回後の目的の長さの分子数を整数で求め、全二本鎖に占める割合を既約分数で答えてください。さらに、別の測定資料で5回後の値が理想値と一致しなかった場合、原因を1つに決められるか説明してください。

2回後は全4分子、目的の長さは4 − 4で0分子です。割合は0です。5回後は全32分子、目的の長さは32 − 10で22分子、割合は(22)/(32)、すなわち(11)/(16)です。目的外の10分子を足すと32分子に戻ります。グラフでは総数と目的の数の差がそれぞれ4分子、10分子です。差は増えていますが、総数に占める割合は小さくなります。縦軸が分子数なのか割合なのかで読み方が変わります。

測定値が一致しない理由はこの情報だけでは決められません。増幅が理想どおりに進まないこと、目的外の産物、測定時の損失や検出誤差など、複数の可能性があります。差があるという観察と、その原因の特定を分けます。たとえば比較条件として同じ出発材料の量と測定法を用いた試料を複数用意し、鋳型を含まない対照も設ければ、対照で信号が出るかを調べられます。それでも対照だけで反応効率や損失の原因を一意に決めることはできません。

資料の数値が測定値として与えられたときには、縦軸の単位、測定のばらつき、対照を読む必要があります。差が誤差の幅と同程度なら、差の方向だけで効果を断定できません。理想式は前提の下での予測であり、実際に毎回倍増することを保証する式ではありません。ここでの比較は資料の考察であり、具体的な操作手順や反応条件を定めるものではありません。

間違えた答案を直す

図3のように、全二本鎖の倍増をそのまま目的の長さの倍増と読むと、3回後を8分子と誤答します。総数8は正しいのですが、その中には元の鎖や一端しか定まらない長い鎖を含む組があります。目的の二本鎖という条件を図の各組に付け直すと、答えは2分子です。

もう一つの誤りは、2回後に生じた短い鎖2本を、短い二本鎖2分子と数えることです。各短い鎖の相手は長い鎖なので、目的の二本鎖はまだ0分子です。片方の鎖を数えるのか、両方が短い組を数えるのか、単位を欄の見出しに書きましょう。

また、総数から2nを引く式の2nを「毎回失われる分子」と考えるのも誤りです。ここでは目的の条件を満たさない分子の数であり、系から消えたわけではありません。nが0のときに式を無条件に使うと1分子となりますが、出発分子は長いので0分子です。0回は別に扱い、式を導いた条件を確認します。材料不足や反応の失敗を問題が与えた場合も、理想の倍増式を実測数として使わず、与えられた情報だけで数えられる範囲を判定します。

練習問題

次の各問は互いに独立です。特に断りがなければ、出発分子は目的領域より両側に長く、冒頭の理想条件が成立します。答えは指定された形にしてください。

1. 長い二本鎖2分子から2回のサイクルを終えます。全二本鎖と目的の長さの二本鎖を整数の分子数で求めてください。
2. 長い二本鎖1分子から6回を終えます。目的の長さではない二本鎖と、目的の長さの二本鎖を整数の分子数で求めてください。
3. 長い二本鎖5分子から1回を終えます。全二本鎖に含まれる元の鎖の本数と、目的の長さの二本鎖の分子数を整数で求めてください。
4. 長い二本鎖1分子から7回を終えます。目的の長さの二本鎖が全二本鎖に占める割合を既約分数で求めてください。
5. 長い二本鎖1分子を用いる別の資料で、ある回に新生鎖が作られなかった鋳型があったとだけ記されています。その後の全二本鎖数を理想式だけで確定できるか、理由とともに答えてください。

練習の答えと考え方

1. 全8分子、目的の長さは0分子です。1分子から2回後は全4分子で、目的の長さでない分子が2・2の4分子あります。2倍して8分子です。全8分子を目的外が占めるので、合計も条件に戻ります。
2. 目的外は12分子、目的の長さは52分子です。全数は2⁶で64分子、目的外は2・6で12分子です。64 − 12が52で、52と12を足すと元の64分子になります。
3. 元の鎖は10本、目的の長さは0分子です。出発時の二本鎖5分子に元の鎖が2本ずつあり、反応後も保存されます。1回後の全10分子はそれぞれ元の鎖と新生の長い鎖の組であり、10本の元の鎖が1本ずつ入ります。
4. (57)/(64)です。全128分子から目的外の14分子を引き、目的の長さは114分子です。(114)/(128)を約分します。114に14を足すと128となり、割合の分母にも一致します。
5. 確定できません。各鋳型が毎回1本ずつ新生鎖を作るという倍増の前提が崩れています。失敗した鋳型の数や時点、その後の各鎖の増幅の成否が与えられていないので、可能な台帳が複数あります。何本が失敗したかを決めてから残りの鎖の由来を追う必要があります。

覚えておくこと

• 総数は理想条件で出発分子数の2ⁿ倍です。
• 両端が定まった鎖と、その鎖2本の二本鎖を区別します。
• 長い出発二本鎖1分子からn回後の目的二本鎖は、nが1以上なら2ⁿ − 2n分子です。
• 反応の失敗や測定誤差がある資料には、理想式をそのまま実測値として当てはめません。

答案のどこを見るか

答えが総数と一致しているときは、2回後の短い鎖の相手が何かを図に書いてもらいます。短い鎖の本数だけを数えた場合は、2本を対にした分子の欄を別に作り、3回目の鋳型と新生鎖を結びます。個別指導では、式を覚えているかに加え、0回や反応失敗という条件の変化で式の適用を止められるかも確かめます。分子を組み立てる2本の由来が、答えの根拠です。