高校生物 PCRプライマー—二本鎖の向きから増幅領域の両端を決める｜武蔵野個別指導塾

二本鎖の端を記してプライマーの伸長方向を追い、逆相補配列と両端を含む産物長を求めます。外側の位置が不明な問題では、長さが決まるかにも注意が必要です。

よくあるのは、二本鎖DNAを見ながら、2本のプライマーを同じ鎖の上に同じ向きで置く場面です。どちらも相補的に結合できそうに見えても、それぞれの3′端から伸びる向きが同じなら、2本で挟んだ範囲を向かい合ってコピーする配置にはなりません。塩基の対応と、端から伸びる方向を別々に確かめることが出発点です。

要点（結論から）

• 鋳型とプライマーは相補的かつ逆平行です。
• 新しい鎖はプライマーの3′端から伸びます。
• 両端に置いたプライマーの伸長方向は内側で向かい合います。

どこを判断する問題か

PCRは、DNAの特定の領域を繰り返しコピーして増やす技術です。問題では、結合する配列を選ぶ型、2本の伸長方向を判断する型、できる二本鎖の長さを数える型がよく扱われます。どの型でも、最初に二本鎖の向きを記し、次に各プライマーの3′端を探します。配列が一致するかどうかと、望む領域を挟むかどうかは異なる条件です。

ここでは二本鎖の左端から右端までを図示し、位置を左から数えます。位置番号は鎖の5′端を表すものではありません。下の鎖は左が3′端で、右が5′端です。したがって、同じ位置を上と下で比べれば相補的な塩基が並びますが、両方の鎖を5′から読むときの向きは逆になります。実在の配列や操作条件ではなく、位置と向きを読み取るための自作の条件を用います。

相補性と伸長方向を分けて見る

DNAの二本の鎖は逆平行で、向かい合う塩基はAとT、GとCで対を作ります。プライマーは短い一本鎖で、相補的な鋳型鎖と結合します。DNAポリメラーゼはプライマーの3′端に新しいヌクレオチドをつなぐため、新しい鎖の伸長方向は5′から3′です。結合した場所だけでなく、その3′端がどちらを向くかを記す必要があります。

図1のように、上の鋳型に結合するプライマーは左向きに伸び、下の鋳型に結合するプライマーは右向きに伸びます。図の矢印は新しい鎖の伸長方向を示し、DNAが移動する方向ではありません。2本の3′端が対象領域の内側を向くと、一方から生じた鎖が後のサイクルで他方の鋳型にもなり、両プライマーで境界を定めた産物が生じます。

プライマーの配列を5′から3′へ書くとき、片方は表示された上の鎖の対応部分と同じ並びになり、もう片方は上の鎖の対応部分の逆相補になります。後者は、まず対応部分の各塩基を相補的な塩基に替え、次に並びを逆にして得ます。左右の位置をそのまま見た相補鎖と、5′から書き直した配列を混同しないでください。

長さを数えるときは、通常、増幅産物に両端のプライマーの配列も含めます。左端の位置をa、右端をbとすると、両端を含む長さはbからaを引き、1を加えた塩基対数です。これは1から4までが4個あるのと同じ数え方です。二本鎖の長さを塩基対で示す場合、2本分の塩基数を足して2倍にしません。片鎖の塩基数と、二本鎖の塩基対数が同じ数になることを区別します。

基本例題：端を含めて数える

ある二本鎖の上鎖を左から右へ5′から3′の向きに表示します。左側のプライマーは下鎖の位置11から15に結合し、右側のプライマーは上鎖の位置36から40に結合します。両者の配列はそれぞれの鋳型に完全に相補的で、結合した3′端から内側へ伸長できるものとします。両プライマーを含む二本鎖産物の長さを、塩基対で求めてください。

図2のように、左のプライマーは位置11から15を占め、右のプライマーは位置36から40を占めます。下鎖の左側に結合した鎖は右向き、上鎖の右側に結合した鎖は左向きに伸びます。この2つの向きは対象範囲の内側で向かい合います。

左端は11、右端は40です。位置11と位置40をどちらも含めるので、40 − 11 + 1 = 30となり、答えは30塩基対です。別の数え方では、左の5塩基対、位置16から35までの20塩基対、右の5塩基対に分け、5 + 20 + 5 = 30です。答えを元の範囲に戻すと、11から始まる30個目は40となります。左端から右端までの間隔29を、そのまま塩基対数にしないことが要点です。

標準例題：同じ文字列でも鎖の向きを直す

上鎖の左端側に5′-ACGT-3′、右端側に5′-AAGC-3′という自作の配列があります。左端側では下鎖に、右端側では上鎖にプライマーが完全に結合するとします。それぞれのプライマー配列を5′から3′の向きで答えてください。2つの位置は離れており、プライマーは内側へ伸びるものとします。

左側は下鎖が鋳型なので、プライマーを上鎖と同じ向きに並べると5′-ACGT-3′です。右側の上鎖5′-AAGC-3′に向かい合う並びは、左から3′-TTCG-5′です。これを5′から書き直すと5′-GCTT-3′になります。左から相補的な文字を置く操作だけでは3′から5′の表記で止まってしまいます。末端表示も含めて答えることで、文字列の反転が必要だと気づけます。

答えを鋳型に戻してみます。左のACGTは下鎖の同じ位置にある3′-TGCA-5′と対を作ります。右のGCTTは右から左に読むと上鎖のAAGCに相補的です。右側のプライマーの3′端は左を向き、左側の3′端は右を向くので、配列と向きの両方が条件に合います。

発展例題：増える分子の由来を追う

長い二本鎖DNAを1分子から始めます。2本のプライマーは望む範囲の両端に結合し、各サイクルで各鎖が鋳型となって新しい相補鎖を1本作る理想化したモデルとします。元の長い鎖から作られる新鎖はプライマーで始まる端を持ちますが、反対側の端は指定された範囲より外まで続くものとします。3サイクル後の二本鎖分子の総数と、両端がプライマーで定まる長さの二本鎖分子数を整数で答えてください。

1回ごとに各二本鎖が2分子になるので、総数は1、2、4、8と増え、3回後は8分子です。ただし8分子がすべて指定長ではありません。1回後は元の長い鎖を含む2分子で、新鎖の一方の端しかプライマーで定まりません。2回目に、その新鎖を鋳型として反対側のプライマーから伸長すると、両端が定まった長さの鎖が生じます。この時点ではその短い鎖は長い鎖と組んでいるので、指定長どうしの二本鎖分子はまだありません。

3回目には、2回目にできたそれぞれの指定長の鎖が鋳型になり、相補的な指定長の鎖を作ります。したがって指定長の二本鎖は2分子です。残る6分子は少なくとも一方に長い鎖を含み、合計は8分子に戻ります。分子全体の倍増と、長さのそろった産物の出現を分けて追うと、2の累乗だけで指定長の数を出してしまう誤りを防げます。この数は完全な伸長を仮定した模型の値で、実測値や成功率ではありません。

資料から結論を絞る

次は、実験結果を読むための自作資料です。対象を含む試料に、向かい合う2本のプライマーを用いた条件Aと、片方のプライマーを含まない条件Bを設けたとします。横軸はサイクル数、縦軸は指定長に相当する信号の相対量で、単位は任意単位とします。たとえば横軸の終点でAが8.0、Bが0.3、読み取りの不確かさがそれぞれ約0.5単位だとします。この数値は教材用の条件であり、実測記録ではありません。

差は7.7単位で、記載された読み取りの不確かさより大きいため、この資料では両プライマーを含む条件と片方を含まない条件で信号に差があります。しかし、信号の長さが想定と合うという情報だけで塩基配列の全体が正しいと断定はできません。鋳型のない対照や既知の対象を含む対照があれば、汚染や検出系の不調を考える手がかりになります。対照に異常があれば、対象があるかないかの結論を急がず、まずその異常を調べます。

グラフの傾きが途中で小さくなっても、それだけで特定の原因を決めることはできません。反応条件や測定の仕組みなど複数の説明がありえます。同じ条件を複数回測り、ばらつきも示して比べることが、1回の結果に引きずられないために役立ちます。ここで扱うのは資料の考察です。実験を行う場合は学校の指導の下で扱い、操作条件はこの問題の判断には使いません。

条件が足りないときの見分け方

配列の候補が複数与えられたとき、同じ短い配列が鋳型の複数の位置に現れる可能性があります。ある位置で相補的だからといって、その位置にしか結合しないとは決められません。候補が対象領域の両側にあり、かつそれぞれの3′端が内側を向くか、位置ごとに表にして調べます。資料に配列の一部分しか示されていなければ、表示されていない範囲での結合可能性は判断できません。答えには、示された範囲で言えることと、残る条件を分けて書きます。

長さについても、プライマーの内側の端しか示されず、プライマー自身の長さが不明なら、両端を含む産物全体の長さは決まりません。内側の距離が同じでも、外側の端の位置が異なれば産物の長さは変わるからです。反対に、外側の端の位置が両方与えられれば、内部の塩基配列が示されなくても位置を数えられます。このように、配列の決定と長さの決定に必要な情報は同一ではありません。

結果の判定では、信号が見えない場合も複数の可能性を考えます。対象がない場合のほか、プライマーと対象の対応が想定と異なる場合や、反応または検出が成立していない場合もあります。既知の対象を使った対照でも信号が見えなければ、対象試料の結果をそのまま不在の証拠とは扱えません。逆に鋳型のない対照に信号が出れば、対象試料の信号も汚染などの影響を受けた可能性があります。対照と一緒に考えることで、結論の範囲を適切に絞れます。

間違いを直す3つの問い

図3の上段のように2本の矢印が右向きなら、両端から対象領域へ向かう配置ではありません。誤答の理由は、プライマーが結合することだけを見て、3′端を確認していないことです。右側のプライマーを反対の鋳型に結合させ、3′端が左を向く配置を考え直します。そのうえで配列の相補性も別に照合します。

もう一つの誤りは、右端の配列に対して相補的な文字を左から書き、そのまま5′からの答えとすることです。相補的な鎖は逆平行なので、左から書いた文字列には3′から5′の端を付けてから反転します。反転だけを先に行って端の表示を省くと、正解した場合も理由を検証できません。

長さの誤答では、右端から左端を引いた数を答えたり、両プライマーを除いた内側だけを数えたりします。問題が求める範囲を先に線で囲み、その線上の最初と最後の位置が含まれるか確認してください。プライマーを含む産物なら両端を含めますが、内側だけを求める別の問題なら、プライマーが占める位置を除く必要があります。どの範囲を数えたかを文章で添えると、計算のずれが見つかります。

練習：問題を先に解く

以下の配列と位置はすべて自作です。各問の二本鎖は上鎖が左から5′、下鎖が左から3′の向きです。結合を指定した場合は完全な相補性を仮定します。

1. 左側のプライマーが下鎖の位置7から12、右側が上鎖の位置58から63に結合します。両端を含む産物の長さを塩基対で求めてください。
2. 上鎖の左側の対応部分が5′-ATGC-3′、右側が5′-CCAT-3′です。左は下鎖、右は上鎖に結合するプライマーの配列を、それぞれ5′から3′で答えてください。
3. 上鎖に結合したプライマーの3′端が左向き、下鎖に結合したプライマーの3′端が右向きです。上鎖側の結合位置が下鎖側より右にあるとき、伸長方向は対象領域で向かい合うか答え、理由を述べてください。
4. 左側プライマーが位置21から26、右側プライマーが位置75から80を占めます。両プライマーを除いた内側の長さを塩基対で求めてください。
5. 理想化した倍増モデルで二本鎖1分子から始めます。各鎖は毎回1本の相補鎖を作ります。4回後の総分子数を整数で答え、指定長の産物がその数と必ず同じか説明してください。

解答と確かめ

1. 63 − 7 + 1 = 57より57塩基対です。7から57個数えると最後は63です。両端の6塩基対ずつと、内側の45塩基対の合計も57になります。

2. 左は5′-ATGC-3′、右は5′-ATGG-3′です。右の上鎖に対して左から相補的に書くと3′-GGTA-5′となり、5′から読み直すとATGGです。左の答えは下鎖の3′-TACG-5′と対になり、右の答えも上鎖のCCATと逆平行に対を作ります。

3. 向かい合います。左側の下鎖に結合したプライマーは右へ、右側の上鎖に結合したプライマーは左へ伸びるからです。鎖の種類だけでなく、どちらの位置が左かという条件も必要です。位置関係が逆なら、同じ向きの矢印でも外側へ離れます。

4. 内側は位置27から74です。74 − 27 + 1 = 48より48塩基対です。全体は位置21から80の60塩基対で、両端の6塩基対ずつを除いても48塩基対です。全体に両端を足し戻すと60に戻ります。

5. 1、2、4、8、16と増えるので16分子です。これは長い元の鎖を含む分子も数えた総数です。指定長の両端を持つ分子がいつ現れるかは鎖の由来に依存するため、総数と必ず同じとは言えません。元の2本の鎖はそれぞれ子孫の分子に残り、指定長より長いという条件なら、少なくともそれらを含む分子は指定長どうしではありません。

要点を手元に残す

• 鋳型とプライマーは相補的かつ逆平行です。
• 新しい鎖はプライマーの3′端から伸びます。
• 両端に置いたプライマーの伸長方向は内側で向かい合います。
• 右側の配列を5′から書くときは逆相補を取ります。
• 両端を含む位置の個数は、右端 − 左端 + 1です。

答案が止まったら、最初に二本鎖の両端を書けているかを見ます。配列の誤りなら、相補性の誤りか、5′から読み直す向きの誤りかを切り分けます。長さの誤りなら、数え始めと数え終わりを指して、プライマーを含む範囲を問い直します。個別指導では、正答だけでなく、図の矢印と式の各項が何を表すかを口頭でも確かめます。向きと端を明示すれば、配列と長さの判断を同じ図からたどれます。