高校生物 呼吸阻害の実験—酸素消費とATP量の変化から作用箇所を推定する｜武蔵野個別指導塾

酸素消費速度とATP量を対照と比べ、同じ結果に複数の阻害機構が整合する理由を検討します。

酸素消費が減ったという結果は、電子伝達に変化が起きた手がかりです。しかし、その数字だけからATP合成酵素が直接阻害されたとは決められません。よくあるのは、酸素消費の減少だけでATP合成酵素阻害と決める場面です。酸素の使われ方、ATP量の測定時点、対照との違いを並べてから、成り立つ仮説と残る別の可能性を分けます。

何を比べる問題か

出方の1つは、処理前後または対照区と処理区の酸素消費速度とATP量を比較し、電子伝達の阻害、ATP合成酵素の阻害、脱共役のどれと整合するかを問う型です。増減の向きを読む前に、同じ時間、同じ試料量、同じ測定条件かを確かめます。ATP量はある時点の蓄えであり、単位時間当たりの合成速度そのものではありません。

もう1つは、時間に対する酸素量のグラフから傾きを求める型です。酸素量が減る線の傾きは負ですが、消費速度は減少量を時間で割った正の値として表します。さらに、複数の処理を組み合わせた資料から作用の順序を考える型もあります。その場合も、問題文のモデルに書かれた条件を使い、実際の薬品の性質まで推測しないことが必要です。

電子の流れとATPの合成をつなぐもの

真核細胞のミトコンドリア内膜では、呼吸で生じた還元型の補酵素から電子伝達系に電子が渡され、最終的に酸素が電子を受け取って水が生じます。電子伝達に伴ってプロトンがマトリックス側から膜間腔側へ運ばれ、内膜を隔てたプロトンの電気化学的な差ができます。電子の移動とプロトンの移動は別の流れです。

図1のように、ATP合成酵素を通ってプロトンが膜間腔側からマトリックス側へ戻ると、その差を利用してADPとリン酸からATPが合成されます。電子伝達は差を作る側、ATP合成酵素は差を利用する側です。物質の流れを矢印で区別すると、片方が止まったときにもう片方がどう影響を受けるか考えられます。

図1の酸素は電子の最終受容体です。電子伝達が強く妨げられれば、酸素消費もプロトンの差を作る働きも低下し、酸化的リン酸化によるATP合成は低下すると予想されます。一方、ATP合成酵素が阻害されるとプロトンが戻りにくくなり、差が大きくなって、さらにプロトンを運び出す電子伝達も進みにくくなります。したがって、どちらでも酸素消費とATP合成が低下しうるのです。

脱共役は、電子伝達とATP合成の結び付きが弱まることです。内膜を隔てたプロトンの差が、ATP合成酵素を通らない経路で失われるモデルでは、ATP合成が低下する一方、電子伝達は差を作ろうとして速くなることがあります。酸素消費が増えてATP量が減る組合せは、このモデルと整合します。ただし基質や酸素が不足していれば増加しない場合もあり、増減の組合せを無条件の判定表として扱えません。

測定したATP量は、合成と消費の両方の影響を受けます。合成が低下しても消費が同じなら量は減りますが、消費も変われば量の変化は別になります。また、細胞全体を測る場合には解糖系などによるATP供給も含まれます。以下の資料は、条件を明示した自作の教材用データです。実測値ではありません。

基本例題：同じ時間の減少量を比べる

分離したミトコンドリアを含む同量の試料を、酸素と基質が十分ある同一条件に置きます。対照区には溶媒のみ、処理区には溶媒と物質Xを与えました。開始時と5分後の溶存酸素量を測り、5分後のATP量も測りました。ATPの消費と膜外の反応は両区で同じとし、試料当たりの量を示します。

酸素消費速度をnmol/分で求め、整数で答えてください。また、この結果が電子伝達の阻害とATP合成酵素の阻害のどちらに整合するか、理由とともに述べてください。両方に整合する場合はその旨を答えます。

図2のように、まず同じ区の開始時と終了時の差を取ります。5分後の残量をそのまま消費量としないことが、最初の注意点です。

対照の消費量 = 100 - 60 = 40 nmol
対照の消費速度 = 40/5 = 8 nmol/分
Xの消費量 = 100 - 80 = 20 nmol
Xの消費速度 = 20/5 = 4 nmol/分

図2の数値に戻すと、対照は100 − 8・5 = 60 nmol、Xは100 − 4・5 = 80 nmolです。両方とも元の終了時の酸素量に一致します。X区では対照と比べて酸素消費速度と5分後のATP量がともに低下しています。

電子伝達の直接的な阻害なら、酸素への電子の供給が減り、プロトンの差を作る働きも弱まるため、この結果と整合します。ATP合成酵素の阻害でも、プロトンが戻りにくくなって電子伝達が抑えられうるため、同じ結果と整合します。したがって答えは「両方」です。数値は作用箇所を1か所に決める証拠にはなりません。

標準例題：傾きと測定の限界

別の自作資料です。同量の試料について、酸素量は対照区で0分に120 nmol、4分に80 nmol、処理Y区で0分に120 nmol、4分に60 nmolでした。いずれも時間に対して直線的に減りました。4分後のATP量は対照区40 nmol、Y区20 nmolです。酸素消費速度をnmol/分の整数で求め、脱共役のモデルと整合するか答えてください。酸素と基質は十分で、ほかの条件はそろっているものとします。

対照の酸素消費速度 = (120 - 80)/4 = 10 nmol/分
Yの酸素消費速度 = (120 - 60)/4 = 15 nmol/分

それぞれ4分間の消費量は40 nmolと60 nmolで、開始量から引くと80 nmolと60 nmolに戻ります。Y区は酸素消費が増え、測定時のATP量が減っています。この組合せはプロトンの差が失われる脱共役のモデルと整合します。ATP量の低下は合成速度そのものを測った結果ではないため、消費速度の変化など他の説明を排除した確定診断にはなりません。

グラフでは横軸を時間、縦軸を試料当たりの溶存酸素量とし、それぞれ分、nmolを付けます。直線の傾きは対照で -10 nmol/分、Yで -15 nmol/分です。消費速度はその符号を反転した正の値です。2点間の平均速度は求められますが、直線という条件がなければ途中の各時点の速度は決まりません。さらに残量が0に近づけば酸素不足によって速度が変わりうるので、直線を測定範囲の外へ延長しません。

別解として、同じ4分間の減少量を先に比較すれば、Yは対照の60/40 = 1.5倍です。時間と試料量が等しいため、速度も1.5倍です。時間が異なる資料では減少量の比をそのまま速度の比にできません。

発展例題：追加の処理で仮説を絞る

教材用の単純なモデルを考えます。物質PはATP合成酵素のプロトンの通り道を阻害し、物質QはATP合成酵素を通らずにプロトンの差を小さくします。Qは電子伝達系を直接阻害しません。Pを加えた後にQを追加すると、Pのみの場合より酸素消費速度はどうなると予想されますか。ATP合成酵素を通るATP合成は回復するかも答えてください。基質と酸素は十分にあり、内膜はQの作用以外では正常とします。

Pによって戻り道がふさがると、膜を隔てた差が大きくなり、電子伝達に伴うプロトンの輸送が進みにくくなります。Qを追加すると別の経路で差が小さくなり、電子伝達が再び進みやすくなります。そのため、このモデルでは酸素消費速度は増加すると予想します。PによるATP合成酵素の阻害は残るので、その酵素を通るATP合成は回復しません。電子伝達の回復とATP合成の回復を同じことにしない点が要です。

対照には溶媒のみ、Pのみ、Qのみ、PとQの組合せを設けます。試料量、温度、基質、酸素の初期条件、溶媒量、測定時間をそろえ、処理する物質を変える条件とします。各区の酸素消費速度とATP量を測り、ATP合成速度は別の測定がない限り推定にとどめます。各区を繰り返し、ばらつきや測定器のずれを点検します。危険のある実験は学校の指導の下で行い、薬品の操作手順はここでは扱いません。

予想と異なり酸素消費が増えなければ、Qが作用していない、基質や酸素が不足した、試料の膜が損傷したなどの可能性があります。測定器の異常や試料の取り違えも検討し、対照を含めて測り直します。結果が予想に合っても、Qが問題文のように働くと独立に確かめていなければ、結果だけでその性質が証明されたとはいえません。

誤答を因果の途中から直す

誤答は「Xで酸素消費が減ったので、XはATP合成酵素を直接阻害する」です。原因は、酸素消費とATP合成酵素の間にある、プロトンの差と電子伝達の関係を飛ばしたことです。図3のように、電子伝達の阻害からも、ATP合成酵素の阻害からも、酸素消費の低下に至る道筋があります。

修正した答案は「電子伝達の阻害、またはATP合成酵素の阻害と整合するが、この結果だけでは直接の作用箇所を特定できない」です。図3の2本の道筋を逆向きにたどると、同じ結果に複数の原因がありうることが見えます。追加実験では、別の経路でプロトンの差を変えたときの反応や、電子伝達とATP合成をそれぞれ直接測った結果を使います。

もう1つの誤りは、ATP量が半分になったので合成速度も半分とすることです。量は貯水槽の水位のように、流入と流出の差で変わります。初期量、合成、消費、測定までの時間を確認し、同じ時点の量から速度を断定しないようにします。酸素の測定値が負になる計算や、試料量が違うままの比較も、条件に戻して見直します。

練習：資料から主張できる範囲を選ぶ

次の5問はそれぞれ独立した自作条件です。数値は実測値ではありません。速度はnmol/分、量はnmolで、指定された整数または分数で答えてください。

1. 同量の試料で、対照の酸素量は0分に90、3分に54、処理区は0分に90、3分に72でした。両区の酸素消費速度を整数で求めてください。
2. 同一条件の対照区と処理区で、酸素消費速度はそれぞれ6と9、同じ時点のATP量はそれぞれ36と18でした。処理区の結果は、脱共役のモデルと整合しますか。確定できるかも答えてください。
3. 酸素量が2分に70、6分に38でした。2分から6分の平均消費速度を整数で求めてください。この2点だけで3分の瞬間の速度を決められますか。
4. 処理後のATP量が対照より低い資料があります。酸素消費は未測定です。ATP合成速度の低下を確定できるか、別の説明を1つ挙げて答えてください。
5. ある区の酸素消費速度は試料2 mg当たり8 nmol/分、別の区は試料3 mg当たり9 nmol/分です。1 mg当たりの速度を整数で求め、どちらが大きいか答えてください。

解答と考え方

1. 対照は (90 − 54)/3 = 12 nmol/分、処理区は (90 − 72)/3 = 6 nmol/分です。3分間にそれぞれ36 nmol、18 nmol消費するため、90から引くと54、72に戻ります。残量の大小と消費速度の大小は逆です。

2. 酸素消費が増え、ATP量が減るので脱共役のモデルと整合します。ただしATP量には消費の変化も影響するため、この2値から作用箇所は確定できません。速度の比は9/6 = 3/2、ATP量の比は18/36 = 1/2です。対照の6と36にそれぞれの比を掛けると9と18に戻ります。

3. 時間の差は6 − 2 = 4分、酸素量の差は70 − 38 = 32 nmolです。平均消費速度は32/4 = 8 nmol/分です。70 − 8・4 = 38で両端の値に戻ります。ただし途中の変化は不明なので、3分の瞬間の速度は決まりません。

4. 確定できません。例えばATPの消費が増えれば、合成速度が変わらなくても測定時のATP量は低下しえます。初期量と経過時間をそろえ、合成と消費を区別する追加測定が必要です。測定値が欠けたときは、酸素消費が減ったと補ってはいけません。

5. 1 mg当たりの速度は前者が8/2 = 4 nmol/分、後者が9/3 = 3 nmol/分です。前者が大きくなります。試料量を戻して掛けると4・2 = 8、3・3 = 9となり、与えられた速度を再現します。試料全体の値の大小と、質量当たりの値の大小を区別します。

手元に残す要点

酸素消費は電子伝達の手がかり、ATP量は測定時の蓄えです。
電子伝達の阻害とATP合成酵素の阻害は、似た結果を生じえます。
脱共役では、条件によって酸素消費が増えATP合成が低下します。
対照と単位をそろえ、測定結果と作用の推定を分けます。

どこで迷ったかを確かめる

酸素消費が減った理由を一言で答えてしまうときは、内膜の両側とプロトンの向きを描き、電子伝達を止めた場合と戻り道をふさいだ場合を別々にたどります。個別指導では、残量から消費速度を作る式と、ATP量が合成と消費に左右される説明を、問題の数値に戻して確認します。異なる仮説が同じ観測値を生むとき、次の測定が推定を前に進めます。