高校生物 細胞分画法—沈殿と上清の比較から小器官の所在を推論する｜武蔵野個別指導塾

指標の回収率と混入を手掛かりに、沈殿と上清から小器官の所在を探る細胞分画です。

沈殿の名前だけで決めてよいでしょうか

よくあるのは、最初の沈殿が完全に純粋だと仮定する場面です。細胞を壊した液を遠心分離し、最初に得た沈殿を「核の分画」と呼ぶ資料を読むと、そこに核以外はないと思いたくなります。しかし、分画の名前は多く含まれる成分に着目した呼び名であり、純粋さを保証する証明ではありません。

資料では、どの分画に小器官の指標が多いかを問う型、分画前の量を基準に回収率を求める型、別の指標が同時に検出された理由を考える型が出ます。いずれも、沈殿の名前に答えを預けず、各段階で何を次に送ったかを追います。ここでは細胞小器官の分離と資料の判定に焦点を当て、個々の小器官で進む反応の経路には立ち入りません。

分画は粒子の行き先を分ける操作です

細胞分画法では、細胞を適切な液中で壊し、細胞内の構造を含む液を得ます。小器官をできる限り保つ条件を選び、分離の結果を調べます。壊し方が弱ければ未破壊の細胞が残り、強すぎれば小器官が壊れ、その内容物が本来とは違う分画へ移ることがあります。実験は適切な器具と安全管理が必要なので、学校の指導の下で行います。

遠心分離では回転によって粒子に外向きの作用が生じ、粒子の大きさや密度、形、液の性質などに応じて沈みやすさが変わります。一般に条件を選べば大きく沈みやすい成分を先に集め、残った液により強い条件を加えて、先には沈みにくかった成分を集められます。大きさだけで順番が必ず決まるわけではなく、同じ成分でも条件によって分布は変わります。

管の底側に集まった部分が沈殿、その上に残った液が上清です。図1は操作の流れを表す模式図で、矢印は液や分画の行き先を示します。第1段階の上清を新しい管に移して第2段階にかけるため、第2沈殿は最初の液をもう一度そのまま分けた結果ではありません。

図1の第1沈殿には沈みやすい核などが多く集まり、第2沈殿には第1上清から沈んだミトコンドリアなどが多く集まると考えられます。ただし実際には粒子の性質が重なり、核以外の粒子が第1沈殿に入り、核の一部が上清に残ることもあります。第2上清にも沈まなかった粒子や溶けた成分が残るので、空の液とみなせません。

指標の量と分母を決める

分画の中身を調べる手がかりとして、特定の小器官に特徴的な物質や酵素活性を指標に使います。指標がある分画に多ければ、その指標を持つ構造がそこに多く含まれると推定できます。ただし指標がその構造に特有であること、測定が妨げられていないことなどを確かめなければ、指標の検出だけで完全な同定はできません。

指標の濃さと、その分画に含まれる総量は別です。総量は、濃度と分画の体積を掛けて求めます。体積が違う分画を濃度だけで比べると、濃いが少量の分画と、薄いが大量の分画の大小を取り違えることがあります。酵素活性を指標にするときも、単位体積当たりの活性と分画全体の活性を区別します。

回収率は、ある指標について分画前の総量を基準にして求めます。対象の分画の指標総量を分画前の指標総量で割り、100を掛けた百分率です。複数の最終分画の回収率は、同じ分画前の総量を分母にしたときに足せます。一方、第2段階だけの回収率を問われた場合は、第2段階に入れた第1上清の総量が分母です。どの段階を基準にするかで数値が変わります。

回収率が高いことと、分画が純粋であることも違います。目的の指標の大部分を集めても、別の構造が一緒に集まれば混入があります。逆に別の指標が少ない分画でも、目的の指標の大部分を捨てていれば回収率は低くなります。両方を見て初めて、集めることと混ざりにくさを別々に評価できます。

基本例題：最初の上清から次の沈殿へ

次の値はすべて教材用の条件です。分画前の液には核の指標Aが100単位、ミトコンドリアの指標Bが80単位含まれます。第1段階で得た沈殿にはAが70単位、Bが20単位含まれ、残りは第1上清にあります。第1上清を第2段階で分けると、第2沈殿にAが6単位、Bが45単位入りました。指標は操作中に失われず、測定値は正確とします。第2上清のAとBの総量を整数で求め、第2沈殿にあるBの、分画前を基準とした回収率を百分率で小数第2位を四捨五入して小数第1位まで求めてください。

まず第1上清に残る量をそれぞれ引き算します。図2の矢印は分画の行き先で、各枠の数字はその分画全体の指標量です。第2段階へ移るのは第1上清に残った量です。

第1上清のA = 100 - 70 = 30単位
第1上清のB = 80 - 20 = 60単位
第2上清のA = 30 - 6 = 24単位
第2上清のB = 60 - 45 = 15単位
Bの回収率 = (45)/(80)・100 = 56.25% ≒ 56.3%

第2上清にはAが24単位、Bが15単位あります。図2の末端にある3分画の合計を戻すと、Aは70 + 6 + 24 = 100単位、Bは20 + 45 + 15 = 80単位です。元の条件と一致します。Bについて第2段階に入った60単位を分母にすれば、(45)/(60)の75.0%ですが、それは分画前を基準にした回収率とは別の値です。

第1沈殿には核の指標Aが多く、Bも20単位あります。Bがミトコンドリアに特有で、測定上の問題もないという条件なら、最初の沈殿にミトコンドリア由来の成分が混入したと考えられます。Aも第2沈殿や第2上清に残っているため、第1沈殿への回収も完全ではありません。

標準例題：濃度ではなく総量を比べる

別の教材条件として、第1沈殿を懸濁した液Pは4 mLで指標Cの濃度が12単位/mL、第1上清Qは18 mLで同じ指標の濃度が3単位/mLです。分画前のCの総量は120単位でした。PとQの総量と、両者を合わせたCの回収率を求めてください。総量は整数、回収率は小数第1位までの百分率で答えます。

Pは4・12 = 48単位、Qは18・3 = 54単位です。Pの濃度はQの4倍ですが、体積の違いによりCの総量はQの方が多くなります。両分画で102単位なので、分画前を基準にした回収率は (102)/(120)・100 = 85.0%です。残りに相当する18単位は回収された2分画では測られていません。

元の場面に戻すと、48 + 54 + 18 = 120単位です。別解として各回収率を先に求めればPが40.0%、Qが45.0%で、合計85.0%です。ただし18単位の差を直ちに廃棄時の損失と断定できません。分注時の取り残し、指標の変化、測定誤差などが候補であり、実際に何が起きたかは追加の確認が必要です。

発展例題：純度と回収率を別に判断する

ある分画法を比べる教材実験で、同じ試料を等分した2組のそれぞれに、目的小器官の指標Dを100単位、別の構造の指標Eを100単位含ませます。方法Xで得た目的分画はDが80単位、Eが30単位、方法YではDが50単位、Eが5単位です。各指標は構造の混入を比較できるとし、測定条件は同じとします。Dの回収率とEの入り込みの割合を整数の百分率で求め、目的分画としての長所を記述してください。

分母はいずれも各組の分画前の100単位です。XはDを80%、Eを30%回収し、YはDを50%、Eを5%回収します。分画に入らなかった量に戻せば、XはDが20単位、Eが70単位、YはDが50単位、Eが95単位です。それぞれ分画前の100単位に合います。

Xは目的指標の回収率が高く、Yは別の構造の指標の入り込みが小さいという長所があります。どちらを選ぶかは、目的成分を多く集めたいのか、混入を減らしたいのかによります。指標DとEの単位数の比だけから小器官の個数比や厳密な純度を求めることはできません。小器官当たりの指標量や、ほかの混入物が示されていないからです。

この比較では、方法だけを変えることが大切です。細胞の種類、分画前の試料量、液の条件、測定方法をそろえます。独立変数は分画方法、従属変数は回収された指標量です。操作を繰り返してばらつきを見て、同じ方法でも異なる結果が出る幅を確かめます。異なる方法の差が小さいとき、1回の結果だけで優劣を断定するのは慎重であるべきです。

誤答を直す：最初の沈殿は純粋とは限らない

基本例題で「第1沈殿は核の分画だからBは0単位」と答えると、与えられたBの20単位を見落とします。図3では、沈殿の呼び名から純粋さを決める道筋と、指標の測定結果から混入を考える道筋を対比しています。矢印は判断の進み方です。

図3のように、まず測定されたBが0かどうかを確認します。Bが20単位という観察事実と、Bがミトコンドリアに特有だという条件から、ミトコンドリア由来の成分の混入を推定します。もしBが検出限界を下回った資料なら、少なくともその測定では検出されなかったと言えますが、絶対に存在しないとまでは言えません。

もう1つの誤りは、第2沈殿のBの45単位を第1上清の60単位で割り、その75.0%を分画前からの回収率と呼ぶことです。式の割り算自体は正しくても、分母が問いと合っていません。問いの「分画前」を丸で囲み、80単位を分母に選び直します。第2段階で入った量を基準にする問いなら、60単位を使うので両方の式がそれぞれ意味を持ちます。

実験結果を読むときの対照と限界

指標の検出が本当にその構造の分布を表すか調べるには、既知の指標を使い、測定系に指標を含まない対照も用意します。対照で反応が出れば、試薬や容器などによる背景を考える必要があります。例えば対照の値が高いときは、それを無視して微小な差を混入と判断せず、背景の原因や測定の安定性を確認します。

分離条件を変えて回収率をグラフにするときは、横軸に問題で与えられた条件、縦軸に基準を明示した回収率と単位の%を取ります。条件を強めると目的指標の回収が増えても、別の指標の入り込みが増えることがあります。両方を同じ分母の考え方で示し、一方の曲線だけから最適と決めないことが重要です。

作図前には表の値と軸の目盛りを照合し、条件を変えた以外の操作と試料をそろえます。複数回の値がある場合は各回の値やばらつきも確認し、平均の差が偶然の変動と区別できるか考えます。回収された指標の合計が分画前を超える場合も、あり得ないとして数値を勝手に直さず、測定のばらつき、背景、体積の記録や計算の誤りを調べます。

装置が途中で止まった場合、指定の条件で分離できたとは言えません。設定と実際の運転状態を確認し、その試料を成功した分画と同列に扱わず、適切な条件で得た試料と比べます。上清を移す際に沈殿を巻き上げた場合も、次の分画に余分な成分が移る可能性があります。操作記録と指標の分布から影響を検討し、必要なら条件を整えてやり直します。

指標の総量の合計が小さい場合は、分画の取り残しだけでなく、破壊による流出や酵素活性の低下、測定の阻害も候補です。指標が活性で測られるとき、活性が減ったことと物質そのものが失われたことは同義ではありません。別の測定や対照と照合し、原因が確かめられる範囲で結論を書きます。

練習：行き先と分母を自分で選ぶ

以下の数値は教材用の条件です。各問いの指標量は分画全体の量であり、別の記載がない限り、操作による損失や測定誤差はないものとします。割合は小数第1位まで、量は整数で答えてください。

1. 分画前に指標Fが200単位あります。第1沈殿に80単位、第1上清から得た第2沈殿に72単位入りました。第2上清の量と、第2沈殿の分画前を基準とした回収率を求めてください。
2. 第1上清の指標Gは90単位で、そのうち第2沈殿に36単位が入りました。第2段階への投入量を基準とした回収率と、第2上清の量を求めてください。
3. 分画Rは5 mLで指標Hが8単位/mL、分画Sは12 mLで2単位/mLです。各分画のHの総量を求め、どちらに多いか答えてください。
4. 分画前に目的指標Jが160単位あり、目的分画に120単位が回収されました。同じ分画に別の構造の指標Kが検出されました。Jの回収率を求め、Kがその構造に特有である場合に言えることを記述してください。
5. 指標Lの分画前の総量は240単位です。最終的な3分画でそれぞれ90、60、42単位が測られました。この問いでは損失や誤差を考慮します。合計の回収率と差の量を求め、差が生じた原因を1つの可能性として挙げてください。

練習の答えと考え方

1. 第1上清は200 − 80 = 120単位、第2上清は120 − 72 = 48単位です。回収率は (72)/(200)・100 = 36.0%です。80 + 72 + 48 = 200単位と戻り、3分画が元の量に対応します。
2. 回収率は (36)/(90)・100 = 40.0%、第2上清は90 − 36 = 54単位です。36 + 54 = 90単位で、第2段階に投入した量に戻ります。分画前の総量は与えられていないので、それを基準とした回収率は求められません。
3. Rは5・8 = 40単位、Sは12・2 = 24単位です。Rの方が16単位多く、(40)/(5) = 8、(24)/(12) = 2と各濃度にも戻ります。ここでは濃度と総量の大小が同じですが、体積が変われば逆転することもあります。
4. Jの回収率は (120)/(160)・100 = 75.0%です。目的分画に入らなかったJは40単位で、120 + 40 = 160単位です。Kが別の構造に特有で、測定が正しいなら、その構造由来の成分の混入が示唆されます。Kの検出は目的分画にJが存在することと矛盾しません。
5. 合計は90 + 60 + 42 = 192単位、回収率は (192)/(240)・100 = 80.0%です。差は240 − 192 = 48単位で、192 + 48 = 240単位に戻ります。例えば移し替えの際の取り残しが候補ですが、この結果だけではその原因に決められません。

覚えておくこと

• 段階的分画では、前の上清を次の遠心分離に使います。
• 分画の呼び名は、完全な純粋さを意味しません。
• 指標の濃度と分画全体の量を分けて考えます。
• 回収率の分母は、分画前か各段階の投入量かを確かめます。
• 混入、損失、測定誤差を区別して結論の限界を示します。

つまずいた箇所を見分ける

上清の量が合わないときは、図の各矢印にその段階で移した総量を書き込みます。第1沈殿を第2段階に送り直していないか、同じ指標を最後まで追っているかを点検すると、どこで流れが入れ替わったか見えてきます。割合が合わないときは、答えに100を掛ける前の分数を読み、「何に対する何か」を口に出して確かめます。

個別指導では、まず試料の行き先を説明し、次に分母を選ぶ理由を説明できるかを確かめます。数式が正しくても、混入の有無を指標の条件なしに言い切っていれば、観察と推定の間に必要な前提を戻します。沈殿と上清の流れを量でたどれば、細胞分画の資料は根拠を持って読めます。