高校生物 酵素反応の阻害—条件を変えた比較から阻害の説明を組み立てる｜武蔵野個別指導塾

基質濃度を変えた初速度の表を、酵素量と対照をそろえて読み、機構の断定を避けながら考える題材は酵素阻害です。

何を変えた試験かを先に見る

よくあるのは、基質を増やした結果を、酵素量を変えた結果と混同する場面です。阻害物質を加えた反応で速度が遅くても、基質を増やすと速度が上がることがあります。そこで「酵素が増えたから速くなった」と書く前に、各試験で酵素の量が同じか、表の条件欄へ戻ります。反応に参加できる酵素の割合が変わることと、加えた酵素そのものの量を変えることは別です。

資料問題には、阻害物質の有無を同じ基質濃度で比べる型、基質濃度を順に変えて速度の差がどう変化するかを見る型、結果から候補を挙げつつ追加の対照を考える型があります。どれも、数字の大小だけでなく、何を固定し何を動かしたかが答えの根拠です。ここでは高校で使う単純な阻害モデルを扱い、実在する分子の細かな構造や結合の種類をグラフから決めることはしません。

活性部位をめぐる競争と、別の場所への結合

酵素は反応を進めやすくする触媒です。酵素の基質が結合する部分を活性部位といいます。基質が酵素に結合し、生成物が生じると、酵素は次の反応にも使われます。阻害物質は、この反応の進み方を妨げる物質です。観測された速度の低下は出発点であり、その理由は対照と合わせて考えます。

図1のように、競争的阻害の単純モデルでは、基質と阻害物質が同じ活性部位を取り合います。阻害物質が部位に結合している間は、基質がそこへ結合できません。基質を増やすと、阻害物質が存在しても基質が結合する機会は相対的に増えます。可逆的に結合するこのモデルでは、基質濃度を十分高くすると阻害なしの最大速度に近づきます。ただし有限の濃度で必ず完全に一致するとは限りません。

図1の右側は、非競争的阻害の単純モデルです。阻害物質は活性部位とは別の場所に結合し、酵素の触媒作用を低下させます。このモデルでは基質を増やしても阻害の影響を取り除けず、十分高い基質濃度で近づく最大速度は阻害なしより低くなります。図は考え方を示す模式図であり、実際の酵素の形や分子の大きさを表すものではありません。

競争的阻害でも非競争的阻害でも、同じ低い基質濃度で速度が低下する場合があります。1点の比較で両者を区別することはできません。また、活性部位以外に結合するという情報だけから、必ずこの単純な非競争的阻害の速度変化になると決めることもできません。結合の位置についての情報と、濃度を変えたときの速度についての情報を分けて読みます。

基本例題：同じ列で比べ、増やす向きを追う

ある酵素について、阻害物質なしをA、物質Pを加えた条件をB、物質Qを加えた条件をCとします。酵素量、液の体積、温度、pHをそろえ、各阻害物質の濃度は加える条件内で一定です。表は教材用に作った初速度の値で、実測値ではありません。基質濃度はmmol/L、初速度はµmol/minです。表の各数値は整数として扱います。

BとCはそれぞれAに比べてどのような変化を示しますか。2つの単純モデルのどちらにそれぞれ近いかを記述し、この表だけから機構を断定できるかも答えてください。さらに基質濃度4でのAに対するBの速度の割合を、百分率で小数第1位まで求めます。

まず基質濃度4の縦の列を見ると、Aは60、Bは50、Cは30です。BとCはどちらも同じ濃度のAより遅いので、両物質の条件で速度が低下しています。次に横方向へ進みます。BとAの差は順に8、12、10、4 µmol/minです。濃度8でBはAに近づきますが、差は途中で一度広がるため、差が常に縮むと書いてはいけません。

割合については、同じ列でBをAで割り、100を掛けます。

Bの割合 = (50)/(60)・100
Bの割合 = 83.3 %（小数第1位）

丸める前の割合は(5)/(6)です。これをAの60 µmol/minに掛けると50 µmol/minに戻り、表のBと一致します。減少した割合を問われたなら、100 %から引いて16.7 %です。残った割合と減少した割合は同じではありません。

図2は濃度1と8の値だけを抜き出した棒です。左の3本と右の3本では基質濃度が異なりますが、どの棒でも酵素量は同じです。左と右を比較して速くなった理由を考えるとき、酵素を追加したことにしないでください。

Bは高濃度でAとの差が小さく、競争的阻害の単純モデルに近い傾向です。Cは各列でAの半分であり、高濃度でも差が残っています。Cは非競争的阻害の単純モデルに近い傾向です。ただし8 mmol/Lが十分な高濃度か、表からは保証されません。表にない濃度の速度や最大速度は測定されていません。よって「PとQの実際の結合位置まで確定した」とは書けません。

同じ数字の見方には別の方法もあります。各濃度でBとCをAで割ると、Bは順に60 %、70 %、約83 %、95 %です。Cは順に50 %、50 %、50 %、50 %です。絶対差だけでなく無阻害に対する割合を見ると、基質を増やしたときにBの阻害の影響が相対的に小さくなることが読み取れます。割合を比べる場合も、分母はその濃度に対応するAです。

標準例題：生成量から初速度を作り、対照と比べる

一定時間内に生成した物質の量から速度を求めることもあります。酵素量と基質濃度を同じにした2条件D、Eを考えます。反応開始後の最初の3分間はどちらも生成量が時間に比例し、酵素を加えない空試験の生成量は0です。Dは阻害物質なしで9.0 µmol、Eは阻害物質を含み6.0 µmol生成しました。数値は教材条件です。初速度を有効数字2桁で求め、Eの低下率を百分率で小数第1位まで求めてください。

時間に比例する区間なので、生成量を時間で割ればその区間の速さです。単位にも分母の時間が必要です。

Dの初速度 = (9.0 µmol)/(3 min) = 3.0 µmol/min
Eの初速度 = (6.0 µmol)/(3 min) = 2.0 µmol/min
低下率 = (3.0 - 2.0)/(3.0)・100 = 33.3 %

小数に丸める前の低下率は(1)/(3)です。Dの3.0 µmol/minからその(1)/(3)を引くと2.0 µmol/minとなり、3分で6.0 µmolに戻ります。DとEの比較から、この条件では阻害物質を含むEが遅いといえます。一方、基質濃度は1種類なので、競争的か非競争的かまでは選べません。

空試験で酵素によらない見かけの生成量が生じるなら、それぞれに対応する空試験を設けて補正します。阻害物質が測定値に直接影響する場合、阻害物質なしの空試験をそのまま共通に使うと誤差が残ることがあります。反応が初めの区間で直線的かを複数時点で確かめ、曲がっているなら全時間の平均を初速度とは呼びません。終了時の総生成量が同じでも、最初の傾きは異なりえます。

発展例題：酵素量の変更と阻害を切り分ける

別の教材実験で、物質Rの効果を調べます。基質濃度とその他の条件は一定で、表の速度は初速度です。物質Rを加えない場合、酵素量と初速度はこの範囲で比例するという条件を与えます。酵素量の単位を相対量、速度の単位をµmol/minとします。表の値は自作の条件です。

Gの速度低下率を整数の百分率で求め、HをFと比べて「Rには阻害作用がない」と結論できるか、根拠を添えて答えてください。また、Hと同じ酵素量でRなしの対照を置くなら、条件から予想される速度を整数で求めます。

Rの効果は、酵素量が同じFとGで比べます。Gの速度はFより6 µmol/min低いので、低下率は(6)/(24)・100 = 25 %です。24 µmol/minの75 %は18 µmol/minとなり、Gの条件に戻ります。FとHは酵素量が異なります。Hの36 µmol/minがFの24 µmol/minを上回っても、Rの有無だけによる比較にはならないため、阻害がないとは結論できません。

Rなしで酵素量を1から2にすると、この問題の比例条件から24・2 = 48 µmol/minです。酵素量2の対照とHとの差は48 − 36 = 12 µmol/min、低下率は(12)/(48)・100 = 25 %です。48の75 %は36となりHに戻ります。ここでは比例が問題文で与えられています。酵素量を変えても比例が成立するかを実験抜きで一般化しないことが大切です。

条件を取り違えた答えを直す

基本例題のBを見て、次のように答えたとします。「基質濃度を1から8にするとBが12から76へ増えた。したがって酵素が増えたので、阻害は消失した。」図3のように、増えたものと一定にしたものを切り分けると、2か所を直せます。

第一に、増やしたのは基質濃度です。酵素量は一定と与えられています。基質が増えて酵素に結合しやすくなると考えることはできますが、速度の増加そのものは酵素量増加の証拠にはなりません。第二に、濃度8でもAは80、Bは76 µmol/minです。差は4 µmol/minあり、表から阻害の消失とはいえません。誤差の大きさが与えられないので、この差が測定のばらつきと区別できるかも判断できません。

直した答えは「酵素量を一定にして基質濃度を上げるとBは速くなり、Aとの差は高濃度で小さくなった。競争的阻害のモデルに近いが、残った差と未測定の範囲があるため機構は確定しない」です。逆に、問題文が酵素量の増加を明示し、基質濃度を一定としていたなら、酵素量の変更を理由に含められます。その場合も阻害物質の効果は、酵素量のそろった対照で別に比べます。

「速度が下がったから酵素が壊れた」という答えにも注意します。低下には結合による阻害のほか、測定条件の違いや酵素の状態の変化など複数の可能性があります。元の条件へ戻して測る試験や、阻害物質を除いた後の再測定は区別に役立ちますが、除去が不完全なら結果の解釈は難しくなります。低速という観察と、失活したという原因の主張は分けます。

比較を確かなものにする試験の組み方

原因を探すには、阻害物質の有無と基質濃度を組み合わせます。基質濃度ごとに阻害物質なしとありをそろえ、酵素量、反応液の体積、温度、pH、測定方法と測定時間を一定にします。変える条件は阻害物質の有無と基質濃度、測る結果は初速度です。阻害物質を加える液の量が違えば、対照にも同じ量の溶媒を加え、希釈の影響をそろえます。実験を行う場合は学校の指導の下で扱います。

縦軸に初速度、横軸に基質濃度を置き、単位を記して各測定点を対応する条件ごとに示します。同じ濃度で縦に比べた後、濃度を上げたときの推移を横に追います。滑らかな線は点の間の傾向を見やすくしますが、測っていない範囲まで正確な値を与えるものではありません。低濃度の数点だけで最大速度を読み取らず、より高い濃度の測定と反復を考えます。

うまく測れなかった場合にも、対照から原因を探します。反応開始時刻の記録が遅れた試験は、最初の時間幅が確かでないので、そのまま初速度として採用できません。同じ条件を新たに測り、記録がそろった反復同士で比較します。測定器が範囲外を示した場合も、表示値を上限値として計算せず、適切な範囲で再測定し、変更した条件を対照にも反映します。

空試験に大きな変動がある場合は、補正後の差が阻害物質の効果なのか、背景の変動なのかを分けられません。空試験と反応試験の両方を繰り返し、測定手順を点検します。試料を取り違えたり、基質を加え忘れたりした場合は、表の数値を都合よく入れ替えず、その試験を特定して記録し直し、対応する条件を再測定します。反復値がばらつく場合には、平均だけでなく個々の値も見て、観測された差との大きさを比べます。

阻害物質を除く試験でも、除去後の速度が戻らなければ直ちに不可逆的な結合と決められません。物質が残っている、除去操作中に酵素の状態が変わった、対照と液の組成が違うといった可能性が残るためです。阻害物質を加えずに同じ除去操作を受けた酵素も測れば、操作自体の影響を調べられます。それでも候補を絞るには、結合を別の方法で調べるなど追加の証拠が必要です。

練習：条件を読み直してから答える

次の5問はそれぞれ独立した教材条件です。速度は初速度とし、特に断らなければ酵素量と反応液の条件は各問の中で一定です。問題を読み終えてから、後の解答で考え方を確かめてください。

1. 基質濃度3 mmol/Lで、阻害物質なしの速度は45 µmol/min、物質Xありでは30 µmol/minでした。Xありの速度はなしの速度の何%ですか。小数第1位まで求め、阻害の型をこの1点から決められるか記述してください。
2. 基質濃度を低・中・高の順に変えたとき、阻害なしの速度はそれぞれ10、20、30 µmol/min、物質Yありでは5、10、15 µmol/minでした。各濃度の阻害なしに対するYありの速度の割合を整数の百分率で求め、高濃度までの傾向がどちらの単純モデルに近いか答えてください。実在の機構が確定するかも述べます。
3. 酵素量1の阻害なし条件で速度が16 µmol/min、酵素量2の阻害物質Zあり条件で速度が20 µmol/minでした。Zの効果を比較する対照として不足する条件を答えてください。阻害なしでは酵素量と速度が比例するという問題条件の下で、その対照の予想速度を整数で求めます。
4. 酵素を含む試験液で反応開始後の最初の2分間に8.0 µmolの見かけの生成量が測定されました。同じ時間の対応する空試験は2.0 µmolで、いずれも時間に比例しました。補正後の初速度を有効数字2桁で求めてください。
5. 物質Wを加えた後、取り除いても速度が戻らなかったため、「Wは酵素を不可逆的に壊す」と結論しました。この結論に対する注意を1つ述べ、除去操作の影響を確かめる対照を記述してください。

練習の答えと解き方

1. 答えは66.7 %です。同じ濃度で、(30)/(45)・100 = 66.7 %とします。丸める前の(2)/(3)を45 µmol/minに掛けると30 µmol/minに戻ります。低下は読み取れますが、1点では競争的阻害と非競争的阻害を区別できません。
2. 答えは各濃度で50 %です。(5)/(10)、(10)/(20)、(15)/(30)はいずれも(1)/(2)です。各阻害なしの速度の半分を取ると、5、10、15 µmol/minに戻ります。高濃度まで割合が変わらないため、非競争的阻害の単純モデルに近い傾向です。ただし測定濃度が十分高い保証はなく、実在の結合機構を確定することはできません。
3. 必要なのは酵素量2でZなしの対照です。与えられた比例条件では16・2 = 32 µmol/minです。酵素量を半分に戻すと32の半分は16 µmol/minとなり、もとの条件と一致します。20と16の比較では酵素量も異なるため、Zの効果を切り分けられません。
4. 補正後の生成量は8.0 − 2.0 = 6.0 µmolです。これを2分で割り、答えは3.0 µmol/minです。3.0 µmol/minで2分間なら6.0 µmolとなり、空試験の2.0 µmolを加えると見かけの8.0 µmolに戻ります。最初の区間で比例するという条件があるので、この割り算が初速度に対応します。
5. Wが完全に取り除かれていない可能性があります。Wを加えず、同じ除去操作を行った酵素を対照にして速度を測れば、操作自体で速度が下がるか確かめられます。対照も低下すれば、観察された低下には操作の影響が含まれる可能性があります。対照が低下しなくても、Wの残存などを別に点検しなければ結合の不可逆性は確定しません。

覚えておくこと

• 比較する前に、基質濃度、酵素量、阻害物質の有無を確認します。
• 競争的阻害の単純モデルでは、基質を十分増やすと阻害なしの最大速度に近づきます。
• 非競争的阻害の単純モデルでは、基質を増やしても最大速度の低下が残ります。
• 速度は同じ濃度の対照と比べ、測定範囲の外の値や結合位置を断定しません。

つまずきの場所を見つける

表の縦方向で比べるべきところを横に読むと、基質濃度の変更と阻害物質の効果が混ざります。まず同じ基質濃度の対照に印を付け、次に同じ阻害条件の行をたどってください。割合が合わない場合は、どの値を分母にしたかを言葉にしてから、求めた割合を元の速度に掛けて戻します。

個別指導で確かめるなら、図3の誤答に対し「実際に変えた量は何か」「濃度8でも差はあるか」と順に尋ね、表のどの欄を根拠にしたかまで説明してもらいます。結論を急ぐ場面では、観察した差、単純モデルとの対応、確定できない理由を別々の文にする練習が役立ちます。酵素反応の阻害は、条件をそろえた比較から読み取ります。