高校生物 遺伝子を扱う技術—増幅と切断の原理から実験結果を読み取る｜武蔵野個別指導塾

PCRで数えるDNA分子と酵素の役割を分け、切断位置から求めた断片長を泳動の帯や対照の結果と照合します。

よくあるのは、PCRの反応を繰り返すとDNAも酵素も同じように倍増すると考える場面です。増える対象と反応を助ける物質を区別しないまま計算すると、式は作れても実験の意味を説明できません。学校の範囲表と授業ノートでPCR、制限酵素、電気泳動がどこまで含まれるかを先に確かめ、それぞれの操作がDNAに何をもたらすかを追いましょう。遺伝情報の発現と発生に関連する技術として扱い、医療上の判断や実際の操作手順には立ち入りません。

答案で問われる3つの読み方

1つ目は、PCRの各段階の役割と、理想的な条件でのDNA分子数です。二本鎖が分かれ、短いプライマーが結合し、DNAポリメラーゼが新しい鎖を伸ばします。何回繰り返したかに加え、毎回すべての対象分子が複製されるという条件が与えられているかを確認します。実際の反応が常にその通りに進むという意味ではありません。

2つ目は、制限酵素で切った後の断片の長さと、電気泳動の帯との対応です。直鎖か環状か、切断箇所がどこか、同じ長さの断片が重なるかを見ます。帯の位置は断片の長さの手がかりですが、帯の数をそのまま断片の総数にしてはいけません。

3つ目は、組換えDNAを用いた結果や対照の考察です。ベクターに目的のDNAをつなぎ、細胞に運ぶという流れを押さえます。目的の帯が現れない場合も、目的配列が存在しないと即断せず、反応や試料を調べる対照の結果と合わせて結論の範囲を決めます。

増やす、切る、運ぶ、分ける

PCRでは、増やしたい領域の両端に対応する2種類のプライマーを使います。二本鎖DNAを一本鎖に分け、プライマーをそれぞれの鋳型に結合させ、耐熱性のDNAポリメラーゼがプライマーの端から新しい鎖を合成します。新しい鎖は次の回の鋳型にもなります。図1のように、対象のDNAは複製されますが、酵素は触媒として働くものであり、DNAと同じ仕組みで倍増する対象ではありません。

図1の矢印は、理想化した1回の複製を表します。出発時の二本鎖DNAが1分子で、各回に全分子が1回ずつ複製されるなら、1回後は2分子、2回後は4分子です。この単純なモデルでは生成物の端の違いを数えず、対象となる二本鎖分子を数えています。プライマー、材料、酵素などが働く条件が維持されるという仮定が必要です。酵素の分子数が反応ごとに倍になるという仮定は含まれません。

制限酵素は特定の塩基配列を認識してDNAを切断します。切断で生じる末端には、一本鎖部分が突き出たものや、両鎖が同じ位置で切られたものがあります。対応する末端を持つDNA断片は、DNAリガーゼによって連結できます。切断と連結は別の働きなので、両者の名前と役割を交換しないようにします。

ベクターは目的のDNAを細胞へ運ぶために使うDNAです。例えば環状のプラスミドを切り開き、目的の断片と連結して組換えDNAを作ります。細胞内で目的のDNAを増やしたり、条件が整えばその遺伝子を発現させたりする利用があります。ただしDNAを運んだだけで必ず目的のタンパク質が作られるとは限りません。増幅や検出にもこのような技術が使われますが、目的に合う条件と対照を伴って初めて結果を判断できます。

電気泳動では、負に帯電したDNA断片がゲル中を正極側へ移動します。同じ条件で比較すると、一般に短い断片ほど遠くへ移動します。長さのわかっているDNAを同じゲルで流せば、試料の帯の位置を比較できます。帯が濃いかどうかはその位置のDNA量などにも影響されるため、位置だけから配列の内容まで決めることはできません。

組換えの結果を調べるときには、目的の断片が入らずにベクターだけが再びつながった場合や、目的と異なる断片が入った場合も考えます。切断後の長さが予想と一致することは候補を絞る手がかりですが、同じ長さの別の配列を区別するには別の確認が必要です。目的DNAを入れない対照と比べると、操作によって得られた結果を解釈しやすくなります。

泳動像を読む際は、まず試料を入れた位置と正極の方向を確認します。次に長さが既知の断片の位置と照合し、各試料の帯を比べます。帯が見えないときも、DNAがない場合と、量が検出限界より少ない場合、操作や検出がうまく進まなかった場合を区別する必要があります。資料に示されていない条件を勝手に補わず、結果から言える範囲を答えます。

同じ泳動条件であっても、長さが近い断片は十分に分離しないことがあります。問題で分離できると指定された場合と、実際の帯から判断する場合は分けて考えます。

基本例題：直鎖の切断と帯

次は計算のための自作条件です。長さ1200塩基対の直鎖DNAを、左端から300塩基対と800塩基対の位置で切る制限酵素を使い、すべての分子が両方の位置で完全に切断されたとします。得られる断片の長さを塩基対の整数でそれぞれ答え、同じ条件の電気泳動で何本の位置に帯が見えるか答えてください。ただし異なる長さの断片は分離し、検出できるものとします。

まず直鎖の左端を0、右端を1200として、切断位置を順番に並べます。図2のように、端と切断位置の間の距離が、それぞれの断片の長さです。

左端から最初の切断位置までは300 − 0 = 300塩基対です。次の切断位置までは800 − 300 = 500塩基対です。最後は1200 − 800 = 400塩基対です。したがって断片は300、500、400塩基対の3種類で、長さが互いに違うので帯は3本の位置に現れます。泳動では300塩基対の断片が最も遠くへ、500塩基対の断片が最も近くに残ります。

答えを元の直鎖に戻して確認します。300 + 500 + 400 = 1200塩基対となり、出発したDNAの長さに一致します。切断位置を長さそのものと見て800塩基対の断片を作ると、合計が元の長さを超えてしまいます。切断箇所を端からの座標として読み、隣り合う座標の差を取ることが根拠です。

完全に切れなかった場合、この答えをそのまま実験結果に当てはめることはできません。切れ残った分子や一部だけ切れた分子は、別の長さの帯を生じる可能性があります。逆に予想の帯が出ても、同じ長さの別配列が混じる可能性があるため、帯の位置だけで配列全体を確定しないようにします。

一歩進める：対照を使って結論を絞る

自作の資料を考えます。ある試料から目的配列をPCRで調べます。試料A、目的配列を含むと既知の対照B、DNAを加えない対照Cを、同じ反応条件で別々に調べました。予想される長さの帯はAで見えず、Bで見え、Cでは見えませんでした。試料Aには反応を妨げる物質が含まれる可能性があります。この結果から試料Aについて言えることと、言い切れないことを「増幅」「阻害」の2語を使い、2文程度で述べてください。

解答例は「試料Aでは目的の長さの増幅産物が検出されませんでした。阻害の可能性があるため、目的配列が存在しないとは言い切れません」です。Bに帯があることは、その対照の反応系で予想の産物が検出された根拠です。Cに帯がないことは、その対照で予想位置の産物が検出されなかったことを示します。しかしBやCの結果は、Aに含まれる物質がAの反応を阻害しなかった証明にはなりません。

切り分けるには、Aの試料を加えた条件と加えない条件の双方で、既知の鋳型が増幅されるか比べる方法が考えられます。Aを加えたときに限って既知の鋳型の産物が検出されなければ、Aに由来する阻害を疑う根拠になります。それでも試料の量や検出条件などをそろえ、別の原因を検討する必要があります。Bにも帯が出なければ、Aの有無以前に反応系や検出の問題を考えます。Cに帯が出た場合は混入などを疑い、Aの帯だけで結論を出せません。

誤答を直すときの目印

「PCRを3回行うとDNAとDNAポリメラーゼがともに8倍になる」という答えは、複製されるものと触媒を混ぜています。理想条件なら対象DNAの分子数は2倍を3回繰り返して8倍です。一方、酵素は新しい鎖の合成を助けますが、PCRでその酵素自身の分子数が倍増するわけではありません。図3のように、矢印を引く前に、数を数える対象と反応を支えるものを分けます。

図3ではDNAの分子数の変化を示し、酵素は合成を助ける役割として別に置いています。酵素の量や活性が実際に一定だと保証する図ではありません。反応が進まない場合は、鋳型やプライマーの対応、酵素の働き、材料、検出の各段階を考え、どこが原因か対照で絞ります。

もう1つの誤りは「帯が2本だから断片も必ず2個」とすることです。同じ長さの断片が複数あれば同じ位置に重なり得ます。断片の本数は切断位置から数え、観察される帯の位置は長さの種類から判断します。環状DNAでは1か所切っても直鎖が1本になるため、直鎖での数え方をそのまま移すことも避けます。

練習問題

次の条件と資料はすべて学習用に作ったものです。答えを読む前に、対象、条件、求める量をそれぞれ書き出してください。

1. 二本鎖DNAが最初に3分子あります。各回に全分子が1回ずつ複製され、材料などの条件が保たれるとします。4回後の分子数を整数で答え、DNAポリメラーゼの分子数について同じ倍率を適用できるかも答えてください。
2. 長さ1500塩基対の直鎖DNAを左端から400塩基対と1100塩基対の位置で完全に切ります。断片の長さを塩基対の整数で示し、異なる長さは分離して検出されるとき、帯の位置の数を答えてください。
3. 長さ2400塩基対の環状DNAを、ある制限酵素で2か所切ったところ、断片の一方は900塩基対でした。もう一方の長さを塩基対の整数で答え、切断前後の長さの合計を比べてください。
4. 目的配列を検出するPCRで、試料と既知の陽性対照の両方に予想の帯がなく、DNAを加えない対照にも帯がありませんでした。この結果から試料の目的配列の有無を決められるか、「対照」「反応」の2語を使い2文程度で説明してください。

練習の答えと道筋

1. 48分子です。3分子から順に6、12、24、48分子と数えます。逆に48を4回続けて半分にすると3に戻り、出発数と一致します。DNAポリメラーゼは複製を助ける酵素なので、DNA分子と同じ倍率を適用できません。実際の反応では理想条件が崩れ得ることも区別します。

2. 400、700、400塩基対で、帯の位置は2か所です。左端から400、次は1100 − 400 = 700、残りは1500 − 1100 = 400塩基対です。400 + 700 + 400 = 1500で元の長さに戻ります。400塩基対の2断片は同じ位置に重なるため、断片3個と帯の位置2か所を混同しません。

3. 1500塩基対です。環を2か所で切ると2つの断片となり、2400 − 900 = 1500です。900 + 1500 = 2400となり、切断前の環全体の長さに戻ります。直鎖では両端も区切りになりますが、環には最初から端がありません。

4. 解答例は「陽性対照にも帯がないため、試料に目的配列があるか決められません。反応や検出に問題があった可能性を調べます」です。DNAを加えない対照に帯がないことだけでは、陽性対照が正常に増幅された根拠になりません。反応系を見直し、対照で期待する結果が得られてから試料を再評価します。

覚える道筋

PCRは鋳型を増やし、酵素は合成を助けます。
制限酵素の切断位置から断片の長さを求めます。
ベクターは目的のDNAを細胞へ運びます。
泳動の帯は長さを比較し、対照で結論の範囲を絞ります。

答案のどこを点検するか

PCRの式が合っていても酵素の説明が曖昧なら、何を数えているか図に書き込んでみます。切断の計算で合計が元の長さに戻らない場合は、座標と区間の長さを分けて書き直します。個別指導で確かめる際には、本人が描いた直鎖や環の切断位置、同じ長さの断片の重なり、対照ごとに言えることを答案の横で照合します。予想と違う結果にも別の原因を残せる答案は、遺伝子を扱う技術の理解を支えます。